ADGRG2의 기능 연구를 통한 남성 생식에서 GPCR의 역할 규명
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정자 이동 통로인 날세관은 고환에서 생성된 정자가 부고환으로 이동하는 통로인데,이곳에서 수분 및 pH가 일정하게 유지되지 않으면 포유류에서는 불임을 유발함。날세관 및 부고환에서 매우 높은 발현율을 보이는 GPCR의 일종인 ADGRG2은 유전자 결실된 수컷 쥐 실험을 통해서 날세관의 pH 조절 및 수분 재흡수 작용을 통해 ADGRG2이 정자의 이동에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌음.세계적으로 가임기 부부의 15%가 불임이며,이 가운데 남성 불임이 50%를 차지함.폐쇄성 무정자증은 남성 불임의 주요 원인이며,특히 선천성 정관 형성 부전증이 대표적임.최근 이 환자들에서 ADGRG2 돌연변이가 발견되면서 ADGRG2에 의한 남성 생식 기작에 대한 연구가 매우 필요한 상황임.하지만 ADGRG2는 고아 GPCR로서 내인성 혹은 합성 리간드가 알려지지 않음.ADGRG2의 N-terminus의 내부 특정 15개 아미노산 서열(tethered 펩타이드)이 agonist처럼 작용하는 것으로 알려져 있으나 그 활성이 매우 낮음.그리고 특정 Gα 아형과 혹은 특정 β-arrestin 아형 중 어느 신호 전달을 하는지에 대한 정량적 분석의 부재함.그러므로 본 연구과제에서는'선택적 리간드에 의한 ADGRG2 활성의 조절은 특정 하부 신호전달 체계를 통해 날세관에서의 pH 및 수분 재흡수를 조절한다.'라는 가설을 바탕으로 1)ADGRG2의 선택적 agonist를 발굴하고 2)ADGRG2 특이적인 하부 신호 전달 체계를 분자적 수준에서의 규명하므로서(3)날세관에서 ADGRG2를 통한 pH 및 수분 재흡수 조절 기작을 제시하고(4)남성 불임 환자에서 발견된 ADGRG2 돌연변이에 의한 남성 불임 발병 기전을 제시하고자 함
1.세포 내에서의 ADGRG2의 활성 기작 연구 방법 1.1 HTS를 통한 성공적인 리간드 규명을 위해서는 스크리닝 assay의 선택이 매우 중요함.beta-arrestin 매개 발광 유전자 전사 활성 방식(beta-arrestin Tango assay)은 signal window가 크고 HTS platform에 적용하기 쉬워 고속 리간드 활성 검사법에 적합하다는 장점이 있음.또한 고아 GPCR의 리간드 발굴을 위해서는 리간드가 없는 상황에서의 basal 활성이 충분히 존재하는지를 측정하는 것이 중요한데,본 연구자의 최근 예비 연구를 통해,ADGRG2의 DNA 양과 비례하여,beta-arrestin basal 활성이 충분히 증가하는 것을 확인하였음.1.2 HTS 및 펩타이드 최적화를 통해 발굴한 최종적인 ADGRG2 선택적 리간드들의 검증 혹은 환자에서 발견된 돌연변이의 활성 연구를 위해서는 더욱 정교하게 ADGRG2 신호 전달 경로를 분석해야함.본 연구자는 Ca++assay 및 BRET 기반 TRUPATH(G-protein TRansdUcer PATHway)센서 방식을 적용할 계획인데,이는 14개 G transducer 아형(Gi1,Gi2,Gi3,GoA,GoB,Gz,G12,G13,Ggust,Gq,G11,G15,GsShort,GsLong)를 동시에 같은 조건에서 측정 및 정량화할 수 있다는 장점이 있음.여기서 언급한 assay 모두 본 연구자가 사용해서 논문을 출판한 경험이 있는 만큼,ADGRG2의 새로운 리간드 발굴 및 검증에 도움이 될 것이라 생각함.2.Tethered 펩타이드 최적화 전략ADGRG2의 tethered 펩타이드의 최적화를 이를 위해 가장 가까운 ADGRG4,ADGRG6의 peptide 서열과의 비교를 통해서 보존이 잘된 서열은 우선 치환하면서 서열을 바꾸는 방법을 통해 최적의 tethered 펩타이드를 디자인하고자 함.효과적인 펩타이드 디자인을 위해서는 치환할 아미노산 type을 결정하는 단계가 매우 중요한데,이를 위해서는 molecular docking 을 이용하려고 계획 중이며 computational biology 분야의 전문가인 중앙대학교 약학대학 이윤지 교수님과 공동연구를 진행할 예정임.이와 더불어,펩타이드 서열 각각을 alanine 치환하여 각 서열의 중요도를 평가하여 펩타이드 서열을 최적화하는 연구를 계획함.이 방법의 경우 mouse ADGRG2를 대상으로 이미 실험을 통해 규명된 것이 있어,문헌을 참고하여 우선 실험을 수행할 계획임.3.ADGRG2 합성 리간드 발굴3.1 성공적인 리간드 규명을 위해서는 화합물확보가 중요한데,먼저 한국 화합물 은행에서 제공하는 다양한 화합물 10만종을 이용하여 연구를 진행하려고 함.또한 외국 회사에서 제공하는 화합물 라이브러리를 구매할 계획인데,기존에 ADGRG3의 리간드를 성공적으로 발굴하는데 사용되었던 Prestwick 라이브러리와 ADGRG2가 생식에 관련된 단백질인 만큼,endocrine 및 steroid 라이브러리를 구매할 계획임.3.2 동시에 컴퓨터를 이용한 가상화합물 디자인 방식을 동시에 적용하고자 함.구조가 규명된 ADRGR3의 transmembrane 의 구조적 상동성에 근거해 lipid 계열의 화합물을 우선하여 테스트하고자 함.이 연구 수행을 위해서 이 분야의 전문가인 중앙대학교 약학대학의 이윤지 교수님 연구팀과 공동연구를 계획 중.3.3 최종 리간드(화합물 혹은 펩타이드)의 off-target activity를 보기 위해 380개의 GPCR을 대상으로 GPCRome screening하고,최종 선택된 리간드는 쥐의 날세관 primary culture로 하여 1)날세관에서의 pH 측정 및 2)날세관에서의 수분 재흡수를 측정하고자 함.이를 위해 이 분야 전문가인 을지병원의 이기호 교수님에게 조언을 구할 예정.
1.연구 과제의 기대 효과현재 FDA 승인 약물의 30~40%의 표적 단백질인 GPCR은 의학적으로 매우 중요한 막단백질임.하지만 고아 GPCR은 그 조절 리간드가 존재하지 않으므로,그 생리학적 기능 및 관련 질병 기작에 대한 이해가 매우 부족한 상황이므로,이들의 리간드를 찾는 연구는 새로운 생리 기작 및 질병 기작의 이해에 매우 중요하다고 할 수 있음.따라서 고아 GPCR인 ADGRG2의 조절 리간드의 발굴 및 활성 기작의 이해는 남성 생식,그 중에서도 정자의 이동을 이해하는데 매우 중요한 역할을 할 것이라 기대함.즉 남성 불임에 대한 GPCR의 역할을 규명함으로써,남성 불임 치료에 GPCR 표적 치료법을 제시할 수 있는 근거 및 새로운 치료제 후보 물질을 제시할 수 있다고 기대함.2.연구과제의 활용방안고아 GPCR인 ADGRG2의 활성 기작을 분자적 수준에서 제시함으로서,ADGRG2의 선택적 리간드를 이용해서 날세관에서의 ADGRG2의 새로운 신호 전달 단백질의 발굴 및 기능적 coupling을 하는 이온 채널의 발굴 등의 남성 생식에 관련된 ADGRG2의 연구를 가속화시킬 것으로 기대함.또한,세포내의 ADGRG2의 활성을 조절하는 endogenous 리간들 발굴하는데 도움이 됨.특히,현재 X-ray 나 cryo EM 기술의 발전으로 인해 구조가 규명되는 GPCR이 늘어나는 상황에서,이번 연구에서 발굴한 선택적 리간드 및 특정 신호 전달체를 이용하면,ADGRG2-리간드-특정 G protein complex 또는 ADGRG2-리간드-특정 arrestin 등의 신호 전달 복합체의 구조 규명에도 유용하게 사용될 것이라 기대함.