水稻是我国主要粮食作物之一,在我国种植面积不会发生重大变化的社会环境下,通过增加水稻的亩产便成为我国粮食每年保持增产的根本途径和确保国家粮食安全的有力保障。而氮素是限制水稻生长、发育和影响水稻亩产的最重要因素之一,因此水稻氮素利用相关性状的研究对水稻遗传改良具有重要意义。本研究利用一套以粳稻品种日本晴为供体亲本和籼稻品种广陆矮4号为轮回亲本构建的染色体单片段代换系（Chromosome Single Segment Substituted Lines,CSSLs）为材料,以株高（PH）、根干质量（RDW）、苗干质量（SDW）、总干质量（PDW）、氮素生理利用效率（NUE）以及氮素积累总量（NA）等6个性状作为高低氮两种条件下研究氮素利用相关QTL的检测指标并对其进行了 QTL鉴定,主要研究结果如下:1、染色体片段代换系群体和亲本的株高（PH）、根干质量（RDW）、苗干质量（SDW）、总干质量（PDW）、氮素生理利用效率（NUE）以及氮素积累总量（NA）等6个性状的表型分析表明（表1）,双亲（粳稻品种日本晴和籼稻品种广陆矮4号）和染色体片段代换系群体在低氮（LN）条件下的株高（PH）、苗干质量（SDW）、总干质量（PDW）、氮素积累总量（NA）均比高氮（HN）条件下有不同程度地降低,而根干质量（RDW）增加。因此表明水稻幼苗在低氮（LN）条件下能诱导根系抑制地上部茎叶的生长,并且广陆矮和日本晴两亲本对低氮（LN）条件的反应是一致的。从染色体片段代换系群体来看,各性状值均表现连续正态分布且呈双向超亲分离现象,表现出数量性状的特点（图1）。2、高氮（HN）和低氮（LN）条件下水稻苗期各性状的相关性分析表明（表2）,水稻苗期高低氮两种情况下的株高（PH）、根干质量（RDW）、苗干质量（SDW）和氮素积累总量（NA）均表现出极显著的正相关性,说明水稻苗期的生长发育是水稻地下部根系和水稻地上部茎叶协同作用的结果。其中低氮（LN）条件下株高（PH）与高氮（HN）条件下根干质量（RDW）之间的相关系数最小（0.211）,低氮条件（LN）下的根干质量（RDW）和高氮（HN）条件下的根干质量（RDW）之间的相关系数最大（0.924）。3、本实验共检测到高低氮两种条件下株高（PH）、根干质量（RDW）、苗干质量（SDW）、总干质量（PDW）、氮素生理利用效率（NUE）和氮素积累总量（NA）及其相对性状的35个QTL,其中高氮条件下检测到13个QTL,低氮条件下检测到10个QTL,高低氮相对性状检测到12个QTL。检测到2个聚集了不同氮水平及其相对性状的包含多个QTL的区间,称其为QTL热点区,第1染色体的长臂靠近末端附近检测到的QTL热点区和前人已经报道的QTL热点区在同一染色体区域附近,而在第1染色体短臂末端检测到的QTL热点区目前还未发现报道。以上这些结果将为利用分子标记辅助选育水稻苗期氮高效利用品种提供依据。

玉米（Zea mays L.）产量是一个复杂数量性状,受多基因控制。行粒数（kernel number per row,KNR）、穗行数（kernel row number,KRN）、穗长（ear length,EL）和穗重（ear weight,EW）是籽粒产量的组成因子。KERNEL NUMBER PER ROW6（KNR6）为本实验室前期克隆的一个控制穗长和行粒数的基因,深入解析KNR6调控行粒数的作用机制和遗传调控网络,将有助于人类认识产量性状形成的遗传学基础和调控机理,也有利于指导育种实践。本研究主要结果如下:1.KNR6与AGAP蛋白互作:采用免疫沉淀-质谱分析（immunoprecipitation mass spectrometry,IP-MS）共鉴定到135个KNR6互作蛋白。这些蛋白分别参与RNA翻译、生物合成与催化、能量代谢以及细胞内蛋白转运等重要生物过程。通过酵母双杂（yeast two hybrid,Y2H）、萤火虫荧光素酶互补技术（firefly luciferase complementation Imaging assay,LCI-assay）、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,Bi FC）、蛋白质体外结合实验（pull-down assay）等实验,验证了KNR6与一个玉米Arf GTPase activating protein（AGAP）的物理互作。基因表达分析也揭示,KNR6与AGAP具有相似的表达模式和表达区域,暗示这两个基因的编码产物可能在相同的组织区域内富集,为这两个蛋白的互作提供了可能。2.KNR6具有蛋白激酶活性并能磷酸化AGAP:体外表达并纯化KNR6重组蛋白,自磷酸化和底磷酸化物活性检测证实,KNR6具有自磷酸化活性,但突变第74位或第172位氨基酸导致KNR6激酶活性丧失,表明第74位和第172位氨基酸是KNR6激酶活性所必需的。γ-[18O4]-ATP标记磷酸化分析共检测到包含AGAP在内的63个蛋白为KNR6的磷酸化底物,这些检测到的磷酸化底物蛋白主要参与DNA转录、蛋白结合、细胞转运和发育进程等生物过程。体外磷酸化证实AGAP和两个14-3-3蛋白为KNR6的磷酸化底物。酵母三杂分析证实KNR6、AGAP和14-3-3蛋白能互作形成三聚体结构,因此推测14-3-3蛋白可能作为小分子辅助因子参与到KNR6-AGAP的调控途径。3.AGAP在营养和生殖发育中具有多效性:通过CRISPR/Cas9系统,创制了导致AGAP编码提前终止的突变体材料（AGAP knock-out lines,agapko）。发现agapko1家系与野生型（non-transgenic sibling,AGAPNT）相比,花序分生组织（inflorescence meristem）变短、成熟果穗长度变短、果穗上每行籽粒数目减少;agapko2家系植株矮小、茎秆扭曲、叶片弯曲,特别是雌穗发育显著受到抑制且无法正常繁殖、雄穗呈现爪状、花粉管形态异常。因此认为AGAP具有多效性同时影响植株的营养和生殖发育。4.AGAP与KNR6遗传互作共同调控玉米穗长和行粒数:为证实AGAP与KNR6的互作,通过CRISPR/Cas9系统创制了KNR6突变体,相对野生型,KNR6突变体的花序分生组织长度变短、穗长变短、行粒数减少。将knr6ko1与agapko1杂交,在F2群体中分离出AGAP/KNR6、agapko1/KNR6、AGAP/knr6ko1和agapko1/knr6ko1基因型,表型分析发现两个单突变体（agapko1/KNR6和AGAP/knr6ko1）的穗长和行粒数比野生型AGAP/KNR6的短,而双突变体agapko1/knr6ko1的穗长比两个单突变体更短、行粒数更少,即2个基因突变能够增强单基因突变异常表型,表明AGAP与KNR6遗传互作共同调控穗长和行粒数。5.AGAP和Arf GTPase1互作参与囊泡运输:亚细胞定位结果表明AGAP与2个Arf GTPase1（ARF1）蛋白定位于高尔基体。LCI-assay和Bi FC分析发现2个ARF1亚家族成员能与AGAP蛋白物理互作。透射电镜观察发现,agapko细胞中的高尔基体片层变薄、结构弯曲,表明AGAP影响高尔基体形态。另外,agapko根表皮细胞中FM4-64标记的内吞体的内化延迟,BFA（brefeldin A）小体集聚减少,显示AGAP可能参与囊泡运输。推测AGAP与ARF1互作共同参与内吞作用和高尔基体/内质网网络的囊泡运输。KNR6磷酸化AGAP激活AGAP,调控AGAP与ARF1参与的细胞内的囊泡运输。KNR6参与的囊泡运输能维持雌穗花序中生长素含量的平衡,调控花序分生组织发育,影响穗长和行粒数。

水稻作为重要的粮食作物和经济作物,适宜的生育期对产量影响巨大,开花作为其中的一个重要环节,决定水稻从营养生长向生殖生长的转变。PEBP家族基因在开花调控中发挥着重要作用,其亚家族FT-Like家族基因和TFL1-Like家族基因之间具有拮抗功能,但在进化过程中它们的功能也开始发生分化。目前对于水稻开花的分子生物学机制已经有了一定的研究,发现了许多关键基因和重要调控通路,但还有许多基因的功能和所处调控通路需要我们进一步探索。本研究在已有的拟南芥FT基因和水稻FT-Like基因的研究基础上,选取OsFTL4作为研究对象,探究其在水稻生长发育过程中所发挥的作用。通过构建以广陆矮4号为背景的OsFTL4的CRISPR/Cas9敲除突变体,探究OsFTL4的基因功能,主要研究结果如下:1.在对OsFTL4基因进行扩增时得到了两个不同的转录本,其中一个与国家水稻数据中心公布的序列一样命名为OsFTL4.1,另一个在第2内含子出现可变剪切并引起移码导致转录提前终止,将其命名为OsFTL4.2。亚细胞定位结果显示OsFTL4.1在细胞核和细胞质中都有荧光信号,而OsFTL4.2只在细胞核中有荧光信号,不同转录本在细胞中定位结果不同;表达分析表明,OsFTL4.1和OsFTL4.2在根、茎、嫩叶、老叶、叶鞘、节以及不同发育阶段的穗中都有表达,在节中表达量最高;2.系统进化树结果显示,OsFTL4与RCN具有较高的同源性;3.利用CRISPR/Cas9系统在OsFTL4第一外显子处设计gRNA位点进行敲除,利用农杆菌介导的方法将构建成功的载体导入广陆矮4号获得突变体植株,测序分析后得到两种类型的纯合突变:插入G的单碱基突变和缺失GT的双碱基突变,都属于移码突变,即获得了osftl4敲除突变体。对osftl4突变体与野生型材料相比,开花时间明显提前,在海南提前23天,在扬州提前16天;4.种子萌发实验结果表明OsFTL4参与调控种子的萌发,且受GA和ABA的调控;5.不同浓度激素溶液处理野生型和突变体幼苗,结果显示:无激素处理条件下osftl4突变体的幼苗高度低于野生型,但在10-12mol/L的GA溶液和10-12mol/L的ABA溶液处理后突变体的幼苗高度与野生型无显著差异,表明OsFTL4影响水稻幼苗的形态建成并且受GA和ABA的调控。荧光定量结果表明OsFTL4参与GA通路和ABA通路,对GA和ABA的相关合成酶有负调控作用;6.光周期处理后表达量分析实验表明,OsFTL4参与光周期调控通路,位于OsGI和OsHHd1的下游,受OsGI和OsHd1的调控;在SD条件下,OsFTL4与OsHHd3a之间具有竞争关系;7.干旱和盐处理实验结果显示:野生型幼苗比osftl4幼苗更耐干旱和耐盐,表明OsFTL4参与水稻的抗旱和耐盐调控;8.酵母双杂结果表明:OsGF14e可同时与OsFTL4.1、OsFTL4.2和OsFD1互作,表明它们之间可以形成类似于FAC的复合物;OsGF14g和OsGF14h都不能与OsFD1和OsFTL4.1互作而只与OsFTL4.2互作,说明OsFTL4不同转录本之间发生了功能的分化。

水稻是世界最重要的粮食作物之一,为50%以上的人口提供营养来源,我国有65%的人口以稻米为主食。随着人口的快速增加,只有不断提高水稻产量才能满足日益增长的需求,保障全球的粮食安全。戊糖磷酸途径是生物体内糖代谢的重要途径之一,可以为细胞的各种合成反应提供还原力和原料。另外,部分中间产物及酶类与光合作用卡尔文循环的大多数中间产物和酶相同。因此,戊糖磷酸途径是一条重要的多功能代谢途径。转醛醇酶是戊糖磷酸途径非氧化途径中的关键酶之一,但在植物中的相关研究还相对较少。本研究在前期研究基础上,对水稻转醛醇酶编码基因TAL进行了进一步研究,明确了该基因在水稻生长发育中的作用。取得了以下研究结果:1、利用Western blot对TAL基因RNAi和过量表达株系进行目标蛋白含量检测,发现RNAi株系中TAL蛋白含量为野生型的9.0%和38.6%,而过量表达株系中的TAL蛋白含量为242.9%和244.6%;2、对RNAi和过量表达株系进行了农艺性状考察。在温室水培条件下,RNAi株系表现出较弱的生长势,而过量表达株系表现出较强的生长势。在大田条件下,RNAi株系在株高、粒重、主茎穗粒数和单株产量方面均低于野生型,而过量表达株系均高于野生型;3、在武运粳7号背景下,利用CRISPR/Cas9技术,创建了 3个TAL基因完全敲除的突变体。Western blot分析发现,在tal突变体中,内源TAL蛋白几乎检测不到;4、与野生型相比,3个tal突变体的株高、主穗长、主穗穗粒数、千粒重均有极显著下降,但tal突变体的单株穗数与野生型相比变异不显著。tal突变体的单株籽粒产量分别仅为野生型的45.1%、48.2%和40.9%。另外,3个tal突变体的抽穗期显著延迟,在自然长日照条件下较野生型分别晚抽穗14.2天、14.5天和15.3天;5、在温室和大田条件下,测定了TAL基因RNAi和过量表达株系的净光合速率。发现在不同光照强度和二氧化碳浓度下,RNAi株系的净光合速率均低于野生型,而过量表达株系的净光合速率明显高于野生型;6、开花后,RNAi株系胚乳的干重明显低于野生型,而过量表达株系胚乳的干重明显高与野生型。在开花后35天,两个RNAi株系的胚乳干重比野生型分别低16.9%和14.9%,而两个过量表达株系的胚乳干重比野生型分别高6.5%和7.3%;7、我们还对转基因株系的部分品质性状进行了测定。发现两个过量表达株系籽粒的表观直链淀粉含量分别比野生型低8.9%和5.7%,但两个RNAi株系籽粒的表观直链淀粉含量与野生型相比没有显著差异。RNAi株系稻米的胶稠度极显著低于野生型,而过量表达株系稻米的胶稠度极显著高于野生型。以上研究结果表明,转醛醇酶基因TAL的表达对水稻生长发育有重要作用。提高TAL基因的表达有助于光合作用及其产物的累积,促进开花,对多个水稻产量性状均有正调控作用,最终提高产量潜力。本研究为利用基因工程技术提高水稻产量潜力提供了一个新的可能途径。