BackgroundThe regulation of glycolysis and autophagy during feeding and metamorphosis in holometabolous insects is a complex process that is not yet fully understood. Insulin regulates glycolysis during the larval feeding stage, allowing the insects to grow and live. However, during metamorphosis, 20-hydroxyecdysone (20E) takes over and regulates programmed cell death (PCD) in larval tissues, leading to degradation and ultimately enabling the insects to transform into adults. The precise mechanism through which these seemingly contradictory processes are coordinated remains unclear and requires further research. To understand the coordination of glycolysis and autophagy during development, we focused our investigation on the role of 20E and insulin in the regulation of phosphoglycerate kinase 1 (PGK1). We examined the glycolytic substrates and products, PGK1 glycolytic activity, and the posttranslational modification of PGK1 during the development of Helicoverpa armigera from feeding to metamorphosis.ResultsOur findings suggest that the coordination of glycolysis and autophagy during holometabolous insect development is regulated by a balance between 20E and insulin signaling pathways. Glycolysis and PGK1 expression levels were decreased during metamorphosis under the regulation of 20E. Insulin promoted glycolysis and cell proliferation via PGK1 phosphorylation, while 20E dephosphorylated PGK1 via phosphatase and tensin homolog (PTEN) to repress glycolysis. The phosphorylation of PGK1 at Y194 by insulin and its subsequent promotion of glycolysis and cell proliferation were important for tissue growth and differentiation during the feeding stage. However, during metamorphosis, the acetylation of PGK1 by 20E was key in initiating PCD. Knockdown of phosphorylated PGK1 by RNA interference (RNAi) at the feeding stage led to glycolysis suppression and small pupae. Insulin via histone deacetylase 3 (HDAC3) deacetylated PGK1, whereas 20E via acetyltransferase arrest-defective protein 1 (ARD1) induced PGK1 acetylation at K386 to stimulate PCD. Knockdown of acetylated-PGK1 by RNAi at the metamorphic stages led to PCD repression and delayed pupation.ConclusionsThe posttranslational modification of PGK1 determines its functions in cell proliferation and PCD. Insulin and 20E counteractively regulate PGK1 phosphorylation and acetylation to give it dual functions in cell proliferation and PCD.

研究背景及科学问题:完全变态昆虫从幼虫经历蛹再到成虫会发生形态重塑,包括幼虫表皮转变为蛹和成虫表皮,翅芽生长外翻成为翅。蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）调控变态发育,尽管已有大量研究表明20E促进变态发育,但20E调控变态发育中表皮重塑和翅形成的分子机制尚不完全清楚。本文以重大的农业害虫棉铃虫为模型,通过表皮和翅芽转录组测序,筛选变态期高表达的表皮蛋白和转录因子,研究表皮蛋白和转录因子在昆虫变态发育中表皮形态重塑和翅发育中的功能,揭示蜕皮激素调控表皮蛋白表达进而调控昆虫变态发育中表皮重塑和翅发育的分子机制。在理论上阐明了昆虫变态发育的分子机制,发现新的表皮重塑和翅发育的关键基因,在应用上为害虫控制提供新的靶标基因。研究结果:通过免疫印迹实验发现变态发育中表皮没有发生中肠那样的自噬和凋亡。通过取食期、变态期表皮以及变态期翅转录组分析和qRT-PCR检测,筛选出3个在变态期表皮和翅中高表达的表皮蛋白,在棉铃虫基因组中分别命名为DNA-directed RNA polymerase Ⅱ subunit RPB1-like（Rpb1-like）、Extensin、larval cuticle protein LCP-30（Lcp-30-like）。选择在变态期表达量最高并且上调倍数最多的表皮蛋白Rpb1-like进行后续研究。虫体敲降Rpb1-like后幼虫出现表皮异常、不能正常化蛹、死亡及翅发育异常。说明表皮蛋白RPB1-like参与变态发育中表皮重塑和翅的形成。进一步从转录组中筛选到两个在变态期表皮和翅中高表达的转录因子segmentation protein RUNT-like（Runt-like）和protein OVO-like（Ovo-like）。虫体敲降Runt-like后虫体表皮异常、不能正常化蛹、死亡及翅发育异常,与表皮蛋白Rpb1-like敲降后的表型相似,说明转录因子RUNT-like在表皮重塑和翅的发育过程中发挥着重要的作用。敲降Runt-like后发现表皮蛋白Rpb1-like、Extensin的表达水平下降。说明RUNT-like上调Rpb1-like 和 Extensin 的表达。Luciferase实验结果显示,在20E诱导下,过表达的RUNT-like可以使报告质粒中的蛋白Luciferase-GFP表达,证明20E通过RUNT-like上调Rpb1-like表达。虫体注射20E可上调Runt-like表达,而RNAi敲降蜕皮激素核受体（ecdysone receptor,Ecr）和转录因子叉头框蛋白O（foxhead box protein O,Foxo）后Runt-like的表达水平下降。说明20E通过EcR、FOXO促进Runt-like的表达。结论及意义:1.在变态发育中,表皮没有发生像中肠那样的自噬和凋亡。2.在变态发育中,一系列表皮蛋白显著上调。3.表皮蛋白RPB1-like在变态期高表达,参与表皮和翅的发育。4.20E可通过转录因子RUNT-like诱导表皮蛋白Rpb1-like5’上游序列的转录活性。5.20E通过EcR和FOXO促进Runt-like在变态期表皮和翅中高表达。本文以鳞翅目昆虫棉铃虫为模型,揭示了Runt-like是调控昆虫变态期表皮重塑和翅发育的关键基因,Rpb1-like是参与昆虫表皮重塑和翅发育的重要基因。该研究为20E促进变态发育中表皮重塑和翅发育提供了新的理论知识,为农业害虫防治提供了新的靶标基因。

研究背景及存在的科学问题:胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factors,IGFs）是胰岛素样肽（Insulin-like peptides,ILPs）超家族的一员,可以促进组织生长,在哺乳动物中的研究较多,但在昆虫中研究极少,只在果蝇和家蚕中有研究。完全变态昆虫发育中发生组织重塑,即幼虫组织降解和成虫组织增殖,其分子机制一直是昆虫学家研究的热点。有研究表明IGFs在家蚕和果蝇的变态期脂肪体中高表达,但是它们在成虫中肠和脂肪体形成中的作用目前仍不清楚。棉铃虫属于重大农业害虫,其变态发育与棉铃虫种群数量和成灾危害密切相关,本论文针对上述科学问题,以棉铃虫为研究对象,探讨IGFs在棉铃虫变态发育中的作用。研究结果:1.利用生物信息学方法在棉铃虫基因组库中鉴定到了一种IGF,比较其与人IGF-Ⅰ,IGF-Ⅱ氨基酸序列的一致性,将其命名为胰岛素样生长因子-2-样肽（Insulin-like growth factor-2-like,IGF-2-like）,其 mRNA 水平在变态期脂肪体内高表达。2.通过20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone,20E）虫体激素刺激发现20E诱导Igf-2-like表达量增加。3.制备抗IGF-2-like的兔多克隆抗体,并利用蛋白免疫印迹检测了 IGF-2-like在棉铃虫表皮、中肠、脂肪体、脑和去除血细胞的血淋巴五种组织中的表达水平。发现IGF-2-like在中肠和脂肪体的变态期高表达,在脑和表皮中亦有表达,在去除血细胞的血淋巴中的表达量偏低。4.利用组织免疫荧光检测IGF-2-like在中肠和脂肪体中的定位,发现IGF-2-like定位于6th-96 h的成虫中肠细胞中和6th-120 h的成虫脂肪体细胞中。5.利用饲喂dsRNA和注射dsRNA两种方式在虫体中敲降Igf-2-like,发现两种方法敲降Igf-2-like都会导致幼虫化蛹延迟。6.虫体敲降Igf-2-like抑制了 c-Myc表达,从而抑制成虫中肠和脂肪体的生长,成虫体型偏小,寿命延长。结论及意义:本研究鉴定了棉铃虫的一种IGF（IGF-2-like）,证明20E上调Igf-2-like的表达,使其在变态期高表达;IGF-2-like定位在变态期的成虫中肠和脂肪体中;敲降Igf-2-like将会导致c-Myc表达量下调,延迟幼虫化蛹时间,抑制成虫中肠生长和脂肪体增殖,使成虫体型偏小寿命延长。该研究为20E促进成虫组织器官发育提供了理论支持,同时丰富了IGFs信号通路的研究,对病害虫控制有着实际意义。

研究背景、存在的科学问题及研究意义昆虫的生长发育由多种激素共同调控,包括20-羟基蜕皮酮（20E）、保幼激素（JH）和胰岛素,20E与JH和胰岛素相互作用调控昆虫生长发育和蜕皮变态。昆虫变态期间体内发生着剧烈的变化,如幼虫中肠的凋亡、成虫中肠的形成、脂肪体的解体和重构、成虫盘的生长和脑结构的重塑等,20E在其中起着非常重要的作用。通常,蜕皮激素通过结合蜕皮激素的核受体（EcR）来发挥作用,起始20E早晚期基因的表达,启动变态程序,即20E基因组信号途径。近年来,越来越多的研究证明在经典的20E基因组信号途径之外,存在20E非基因组途径,即20E通过激活细胞膜上的受体引发胞内钙离子和cAMP水平的快速变化,进而引起一系列蛋白质的翻译后修饰,调控基因转录和变态发育。G蛋白偶联受体（GPCR）是一类七次跨膜的蛋白家族,在传递各种信号中起到重要的作用,是各种药物的作用靶标。研究发现GPCR作为固醇类激素的受体,在20E调控昆虫的变态发育中发挥作用。果蝇多巴胺蜕皮激素受体DmDopEcR可以结合20E类似物,被认为是20E的膜受体,但DopEcR在20E信号途径中的功能并不清楚,并且棉铃虫中还报道了另外两个传递20E信号的GPCR,但没有检测到它们结合20E。前期研究还发现20E进入细胞的量是受到控制的,但机制和生物学效应并不清楚。这些研究打破了 20E是通过自由扩散进入细胞与核受体结合启动相关基因转录的经典理论,其尚待阐明的科学问题对于确立类固醇激素的细胞膜受体及其信号途径的新理论具有重要的支撑意义。本论文用重大农业害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera）为模型,研究DopEcR在20E信号途径中的功能并证明GPCR可以结合20E,GPCR控制20E进入细胞的机制和生物学效应,丰富和完善20E非基因组信号途径及调控昆虫变态发育的分子机制。研究结果完全变态昆虫在末龄幼虫的最后阶段停止取食,然后发生变态。但是,幼虫停止取食的机制尚不清楚。使用农业害虫棉铃虫作为模型,揭示了 20E与多巴胺受体（DopEcR）（一种G蛋白偶联受体）结合,以停止幼虫取食并促进化蛹。DopEcR在各种组织中均有表达,并在20E调节下的蜕皮变态过程中表达水平升高。幼虫取食阶段的20E滴度较低,而游走阶段的20E滴度较高。相比之下,多巴胺（DA）滴度在幼虫取食阶段较高,而在游走阶段较低。使用多巴胺受体抑制剂flupentixol阻断多巴胺受体或20E注射均可以减少幼虫的食物消耗和体重。敲降DopEcR可以抑制幼虫的取食、生长和化蛹。20E通过DopEcR促进细胞凋亡,DA通过DopEcR诱导细胞增殖。20E通过抑制DA诱导的细胞增殖和AKT的磷酸化来对抗DA功能。20E通过DopEcR诱导基因表达,并使细胞内钙离子和cAMP水平快速增加。20E诱导DopEcR与Gαs和Gαq相互作用。20E通过DopEcR诱导20E信号途径关键蛋白磷酸化和EcRB1-USP1转录复合物与蜕皮激素响应元件EcRE的结合。DopEcR可以在细胞膜或从细胞膜分离后结合20E。DopEcR结合20E位点的突变降低了 20E结合水平和相关的细胞快速反应。研究结果表明20E通过与DA竞争结合DopEcR,抑制幼虫进食并促进化蛹。在棉铃虫中阐明了一种GPCR（命名为GPCR-3）通过触发G蛋白介导的信号级联并形成四聚体促进20E进入细胞传递类固醇激素20E信号。通过虫体RNA干扰从棉铃虫转录组数据库中筛选出GPCR-3参与20E信号途径。虫体干扰GPCR-3导致延迟化蛹或形成嵌合蛹,抑制幼虫中肠和脂肪体的降解,并抑制20E诱导的基因表达。20E诱导GPCR-3与Gαq和Gαs相互作用,并使细胞内钙离子、cAMP和蛋白磷酸化迅速增加。GPCR-3定位于细胞质膜中,20E诱导下被GPCR激酶2（GRK2）磷酸化后内化降解脱敏20E信号,β-arrestin-1和网格蛋白介导GPCR-3的内化。GPCR-3可在细胞膜中和分离后在体外结合20E。20E与GPCR-3的结合诱导GPCR-3的同源二聚体形成同源四聚体,GPCR-3的同源四聚体促进20E进入细胞并传递20E信号。GPCR-3同源四聚体作为20E细胞膜受体并促进20E扩散进入细胞,控制不同组织中20E的滴度,进而调节变态发育中不同组织的发育命运—调亡或增殖生长。结论及科学意义1.本论文研究了 DopEcR在昆虫取食和化蛹中的双重功能,DA通过DopEcR促进幼虫的进食和生长,20E与DA竞争结合DopEcR,并通过DopEcR作为细胞膜受体之一来传递20E信号,从而促进昆虫变态,揭示了类固醇激素与多巴胺系统的互作,阐明了 20E抑制鳞翅目昆虫取食并促进变态发育的分子机制,为类固醇激素信号途径及其与神经系统互作提供了新的理论,为害虫控制提供了新的生长调节剂的研制靶点。2.证明了 ErGPCR-2可以结合20E,支持了前面的研究结论—ErGPCR-2是20E的细胞膜受体。3.证明了 GPCR-3是20E的细胞膜受体,20E结合并诱导GPCR-3形成同源四聚体传导20E信号,并作为转运蛋白易化20E扩散进入细胞。首次发现GPCR可以通过形成同源四聚体促进20E的细胞导入。

研究背景及存在的科学问题昆虫的变态类型分为完全变态和不完全变态,我们所研究的重要农业害虫棉铃虫属于完全变态类昆虫的一种,其组织形态变化极为显著,在昆虫生长发育过程中,蜕皮激素（20E）和胰岛素样肽（ILPs）发挥着重要作用。昆虫的20E信号途径和胰岛素insulin/胰岛素样生长因子信号（IIS）途径（简称胰岛素途径）存在拮抗作用。类固醇激素20E启动昆虫的蜕皮和变态,20E进入细胞内可以与其核受体EcR结合起始下游基因的转录,起始20E的基因组途径。目前研究发现,类固醇激素可以结合细胞膜上的受体起始某些非基因组途径如蛋白质快速修饰,Ca2+水平的快速变化等快速的细胞效应。且在哺乳动物、家蚕、果蝇中已经得到证实。细胞膜上的G蛋白偶联受体（GPCR）属于7次跨膜结构的蛋白家族,在细胞膜上转导包括神经递质,激素等各种信号。人体内有多个GPCRs,是人类中最庞大的膜蛋白家族。已有研究发现在昆虫体内也存在多个GPCRs,我们实验室已经发现有多个GPCRs参与20E的信号转导过程,多个GPCRs共同参与同一配体20E的信号转导,其机制尚未阐明。胰岛素受体（INSR）结合胰岛素来促进幼虫生长和维持正常的血淋巴葡萄糖水平,虽然已知类固醇激素如雌激素和20E均会拮抗胰岛素的功能,但导致这种拮抗作用的分子机制仍不清楚。此外,胰岛素途径的改变会导致糖尿病的发生,胰岛素能维持正常血糖水平而类固醇激素会拮抗胰岛素的功能增加血糖,甚至诱发糖尿病,然而这些机制还没有完全阐明。研究结果在棉铃虫基因组中鉴定了 122个基因编码经典的GPCRs,并对它们进行分类,基因组中未注释分类的GPCRs也进行了重新归类。分析了幼虫中肠转录组中变态期较取食期差异表达的GPCRs,并从中检查了变态期上调表达的1 1个GPCRs及2个下调表达的GPCRs的表达谱,发现它们在虫体的各组织和发育阶段中的表达具有很大差异。进一步证实了 6个GPCRs参与类固醇激素20E信号通路,通过RNA干扰（RNAi）敲降这些GPCRs,幼虫出现不同的表型及延迟化蛹或化小蛹等。敲降这些GPCRs会降低20E信号通路下游基因HHR3的表达,但只有敲降GPCR-催乳素释放肽受体（PrRPR）和Smoothened（Smo）才会导致在20E调控变态过程中起作用的双功能磷酸酶（Pten）和转录因子Forkhead box O（FoxO）的表达下降,敲降PrRPR和Smo同时降低了转录因子BrZ7的表达水平,敲降脂动激素受体Akhr和5-羟色胺受体Htr上调转录因子Krüppel homolog 1（Kr-h1）的表达,敲降以上这四个GPCR后均导致化蛹延迟。敲降Frizzled 7（Fzd7）下调Wnt及cMyc的表达水平,导致化蛹体重减轻,敲降速激肽受体TkR86C没有引起表型的差异变化。通过20E酶联免疫检测（20E-EIA）方法证实了 PRRPR可以结合20E。这些结果解释了多个GPCRs通过不同的表达谱以及对不同基因表达的调控来传递20E信号的机制。20E诱导INSR去磷酸化以拮抗胰岛素信号途径的功能。我们观察到INSR在幼虫取食期表达量及磷酸化水平均较高,但在蜕皮变态期其表达量和磷酸化水平较低。胰岛素使INSR的表达及磷酸化水平均上调,而高滴度的20E则使INSR的表达下调并且诱导了INSR的去磷酸化。20E能上调蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B,由Ptpn1编码）的表达,使INSR去磷酸化。同时,20E上调PTEN表达,维持转录因子FoxO的核定位,定位于细胞核的FoxO促进Ptpn1的表达并抑制Insr的表达。采用RNA干扰技术敲降Ptpn1维持了 INSR的磷酸化,并增加了 20E滴度导致虫体提前化蛹并化小蛹。而敲降Insr抑制了幼虫的生长,减少了 20E的产生导致延迟化蛹并化小蛹,敲降Insr还导致血淋巴葡萄糖的积累。综上所述,这些结果表明,20E通过去磷酸化INSR拮抗胰岛素途径,阻止幼虫生长,积累血淋巴葡萄糖。结论及科学意义1.本论文鉴定了棉铃虫基因组中的全部经典GPCR,并进行归类,对棉铃虫GPCR的研究提供了参考,并发现了 20E的另一个受体PRRPR。20E可以通过结合PRRPR或不结合20E的SMO调控Pten和FoxO的表达。以及20E还可以通过其他的GPCR调控其他基因的表达。这进一步揭示了多个GPCRs通过组织差异表达和调控不同基因表达来传递20E信号,为类固醇激素信号途径的研究提供新的理论依据,为害虫防治提供新的GPCR靶标。2.胰岛素促进幼虫生长,并在幼虫取食阶段促使20E达到临界滴度,临界滴度的20E上调PTEN的表达,使FoxO定位于细胞核中,核定位的FoxO上调磷酸酶PTP1B的表达,使INSR去磷酸化,同时FoxO抑制INSR的表达,从而拮抗胰岛素途径。临界滴度的20E阻止幼虫生长,启动变态过程,诱导血淋巴葡萄糖的积累。这为进一步研究类固醇激素与胰岛素之间的相互作用提供新的思路和依据,为害虫防治提供了新的靶标,同时为血糖代谢的研究提供理论知识,也可以为人类糖尿病的研究提供新的实验模型。

研究背景与科学问题蜕皮激素20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone,20E）和胰岛素样肽（insulin-like peptides,ILPs）拮抗调控幼虫的生长和变态起始。ILPs经由胰岛素/胰岛素样生长因子信号（insulin/insulin-like growth factor（IGF）signaling（IIS））促进细胞增殖和个体发育。20E滴度在蜕皮和变态期较高。20E促进蜕皮激素核受体（ecdysone receptor,EcR）和超气门蛋白（ultraspiracle isoform 1,USP1）转录复合物形成,进而启动与自噬和凋亡相关基因的表达,促进幼虫组织的降解,调控成虫组织重塑;并且不同组织具有不同的命运,如幼虫中肠和脂肪体发生凋亡,成虫中肠和脂肪体发生细胞增殖,而表皮经过转录组重编程进行重塑,但是机制尚不清楚。组织蛋白酶D（cathepsin D,CTSD）属于溶酶体天冬氨酸蛋白酶。CTSD在粗面内质网合成含有信号肽和前导肽的无活性酶原前体形式,然后释放信号肽,经糖基化修饰形成pro-CTSD。随后pro-CTSD运输到高尔基体,随后运输至溶酶体,经未知蛋白酶切割或自身活化,形成成熟的CTSD即mature-CTSD（m-CTSD）,溶酶体膜的选择性透化使m-CTSD进入胞浆,激活半胱氨酸蛋白酶,引起细胞凋亡;pro-CTSD也能分泌到胞外促进细胞增殖。因此CTSD的表达、成熟和分泌是决定其发挥促凋亡还是促增殖功能的关键,但其调控机制不清楚。在乳腺癌中雌激素能促进CTSD表达。在家蚕中,20E能促进脂肪体中CTSD的表达诱导幼虫脂肪体细胞凋亡,但是CTSD调控组织重塑的具体机制也不清楚。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,P13K）是IIS的一个关键激酶。IA型P13K不同形式的催化亚基P110α/β/δ和不同形式的调节亚基P85α/β、P55α、P50α和P55γ之一组成的异二聚体,通过磷酸化磷脂酰肌醇4,5二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2）转变为磷脂酰肌醇 3,4,5 三磷酸（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3）,进而磷酸化活化蛋白激酶 B（protein kinase B,PKB/AKT）促进细胞增殖。研究表明20E和ILPs拮抗调控昆虫的生长发育,但是20E如何调控PI3K从而拮抗IIS的机制还不清楚。本论文利用重要农业害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera）为模型,研究CTSD和PI3K在棉铃虫变态发育过程中的功能,探究CTSD表达、成熟和分泌的机制以及20E诱导细胞凋亡的机制,还有20E和ILPs拮抗调控昆虫生长和变态的机制,系统阐明昆虫变态发育的分子机制,具有重要的意义。研究结果CTSD表达在棉铃虫发育过程中具有组织特异性和发育阶段特异性,CTSD在中肠变态期表达为糖基化的成熟CTSD（glycosylated-mature-CTSD,G-m-CTSD）,在表皮蛹期表达为酶原形式的CTSD（pro-CTSD）,并以糖基化的酶原形式的CTSD（glycosylated-pro-CTSD,G-pro-CTSD）分泌到血淋巴中。点突变实验表明第233位的天冬酰胺的糖基化决定pro-CTSD的分泌。20E通过EcR促进CTSD的表达,并通过自噬诱导CTSD的成熟使其定位在细胞内,促进CASP3片段化进而诱导细胞凋亡。血淋巴中的G-pro-CTSD通过PI3K-AKT通路促进成虫脂肪体DNA内复制、增殖和聚合。20E滴度和自噬相关基因（autophagy-related genes,Atgs）的组织差异可能与CTSD的组织差异表达有某种联系。ILPs在生长期诱导P60和P110磷酸化并促进增殖;变态阶段,20E促进P60表达并诱导P60去磷酸化,抑制P110表达,诱导P110去磷酸化并终止生长。20E通过上调蛋白酪氨酸磷酸酶非受体6型（protein tyrosine phosphatase non-receptortype6,PTPN6）表达并诱导PTPN6与P60和P110互作从而促进P60和P110的去磷酸化,进而阻断ILPs所诱导的P60和P110细胞膜定位并下调P60和P110的互作。磷酸化的P60促进AKT和叉头框蛋白O（foxhead box protein O,FOXO）的磷酸化,并诱导FOXO的细胞质定位从而促进细胞增殖。虫体敲降生长期的P60和P110抑制AKT和FOXO的磷酸化并抑制20E的产生,延迟化蛹。虫体敲降变态期的P60抑制细胞凋亡并延迟化蛹。另外,20E经由ErGPCRs-EcR-FOXO信号轴促进P60表达,并促使其与磷酸酶-张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog,PTEN）互作引起细胞凋亡。这些结果说明磷酸化的P60对于幼虫生长以及20E所诱导的变态发生至关重要。结论与科学意义本论文揭示了CTSD表达具有组织特异性,N233位的糖基化决定CTSD的分泌,自噬诱导CTSD成熟从而诱导幼虫中肠凋亡,G-pro-CTSD促进成虫脂肪体增殖和重聚。在IIS和20E信号途径中,P60通过依赖其磷酸化状态改变具有促进细胞增殖和细胞凋亡的双重作用。本论文阐明了CTSD表达、成熟和分泌的机制,及其在生长和变态的功能,揭示了鳞翅目昆虫在变态发育过程中不同组织具有不同命运的分子机制,并首次发现鳞翅目昆虫的成虫脂肪体会发生细胞增殖;补充了 20E拮抗IIS促进变态的分子机制,为害虫防制提供了理论基础和基因靶标,具有重要的理论意义和实践意义。

研究背景及存在的科学问题昆虫是自然界中种类和数目最庞大的后生动物类群,对人类社会有着重要的影响。因此对昆虫生长发育的研究可以为人类利用益虫和控制害虫提供知识。昆虫的翅在昆虫的迁移、取食、繁殖等方面具有重要的作用,昆虫翅的发育涉及细胞增殖和激素调控,因而研究昆虫翅的发育不仅具有十分重要的理论意义,而且有较高的实践价值。昆虫的生长发育主要受到三种激素的调控,包括胰岛素及胰岛素样肽（insulin、insulin-like peptides,ILPs）、保幼激素（juvenilehormone,JH）和 20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone,20E）。ILPs在促进组织细胞的生长和营养物质的代谢方面发挥着重要的作用,其中人类的松弛素（relaxin）具有促血管生成,抗细胞凋亡以及抗炎症反应等功能。JH维持幼虫状态。20E在促进幼虫组织发生凋亡,成虫组织新生和昆虫蜕皮及蜕皮变态过程中扮演调控因子的角色。成虫的翅由幼虫期的翅盘在变态期快速增殖长大,有研究报道20E促进翅盘增殖,ILPs在翅的发育中发挥作用,但此时幼虫中肠却在凋亡,两种组织在相同的20E滴度的血淋巴中却发生相反的细胞过程,其分子机制尚不清楚。研究结果本文以棉铃虫为实验对象,利用实验室的细胞和虫体研究平台,采取生物化学技术和分子生物学方法,探究了变态期翅盘发育命运不同于中肠的原因;研究了 20E对翅盘生长的调控机制;研究了棉铃虫中类松弛素的胰岛素样肽Ilp6（与人的松弛素关系较近）在翅盘发育中的功能,并取得了如下结果:发现凋亡相关基因在中肠中高表达而在翅盘中低表达,反之,细胞增殖相关基因在翅盘中的表达水平显著高于中肠,可能是两种组织在变态期不同命运的原因;胰岛素受体和20E核受体在中肠和翅盘中没有显著的差异表达,但20E的细胞膜受体GPCR在中肠中高表达,翅盘中低表达,说明20E的膜信号途径在两种组织命运中具有重要作用。注射人重组胰岛素对翅盘的生长没有促进作用,而注射20E可以显著促进翅盘生长,说明20E是促进翅盘生长的激素;但20E对翅盘生长的促进作用依赖一定的浓度;20E从血淋巴进入中肠和翅盘的量存在上限,但翅盘中20E的含量整体低于中肠,可能是20E调控两种组织中基因差异表达的原因;发现Ilp6在脂肪体和翅盘中高表达,虫体RNA干扰（RNAi）敲降Ilp6导致翅发育异常和化蛹延迟,表明Ilp6在发育过程中有着不可或缺的作用。结论、创新点及意义1.凋亡和增殖相关基因的组织差异表达使得翅盘的发育命运不同于中肠。2.翅盘中20E进入量显著低于中肠,翅盘中低含量的20E促进翅盘生长。3.Ilp6在脂肪体和翅盘高表达并且参与了翅的发育和变态发育。本文解释了 20E调控中肠和翅盘在变态期发育不同命运的机制,对了解翅盘的发育提供了参考。

研究背景及科学问题生物体的生长和代谢同时受生长因子和其他激素的调控,它们的活性由相应的受体介导。昆虫生命成长周期主要受三种激素调控,分别为蜕皮激素（20E）、保幼激素（JH）和胰岛素样生长因子（insulinlikepeptide,Ilps）。其中胰岛素信号通路主要控制成长发育,而20E和JH相互作用控制蜕皮变态信号。胰岛素调控幼虫生长达到临界体重,之后释放促前胸腺激素（PTTH）促进蜕皮激素的合成与释放,最后于组织加工成活性代谢物20E。在果蝇中,insulin由胰岛β细胞合成,刺激组织及PG的生长,使PG分泌大量20E,启动变态发育。果蝇中,20E通过促进转录因子dFOXO（ForkheadboxO,FoxO）的核定位和翻译抑制因子4E-BP的转录,对抗胰岛素促进生长的作用。家蚕中,20E对受体复合物EcRB1/USP1及insulin受体在不同的生理条件下有不同的调控作用。棉铃虫的前期研究结果表明,存在一种细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1（CKS1）受20E和insulin共同调节,保证虫体生长和变态,insulin上调CKS1表达,而高浓度20E则抑制CKS1表达。另外发现一种GTP酶-Rab4b介入20E和insulin通路的相关基因的转录调控。20E可以上调磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶（Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate3-phosphatase,PTEN）和叉头框蛋白FoxO的表达,同时PTEN可以通过抑制AKT磷酸化实现抑制FoxO磷酸化,导致FoxO的核定位,实现对胰岛素途径的拮抗。以上研究均表明20E参与胰岛素途径调节,但尚不清楚具体作用机制。本论文以鳞翅目昆虫棉铃虫为模型,选择胰岛素受体IR为靶标,通过激素刺激、双链RNA干扰、构建过表达质粒等实验技术,研究20E对IR的调控,阐明20E调控胰岛素信号途径的分子机制,为害虫的防治提供理论依据和靶标基因。研究结果及结论虫体双链RNA干扰IR,与对照组比,实验组出现高死亡率、化蛹时间延迟及化小蛹等表型。虫体干扰IR后检测到胰岛素通路下游相关基因受到表达抑制。在虫体的发育阶段,IR表达量在取食期高,蜕皮变态期下降。虫体组织和棉铃虫表皮细胞系上,insulin以浓度和时间依赖的方式上调IR表达。而20E则是依赖浓度梯度双向调节IR表达,低浓度20E促进IR表达,高浓度20E抑制IR表达。在HaEpi细胞系上叠加insulin和不同浓度的20E刺激后得到相同结果,低浓度20E促进insulin诱导的IR表达和磷酸化,而高浓度20E抑制insulin诱导的IR表达和磷酸化。Ilps在棉铃虫幼虫到蛹的发育时期均有表达,并且在末龄幼虫和蛹期呈现上调表达趋势,说明末龄幼虫和蛹期20E不是通过抑制IPs的表达来抑制IR磷酸化的。放线菌酮及专门抑制磷酸酶的一种抑制剂预处理细胞后发现高浓度20E抑制IR磷酸化现象减弱,意味着高浓度20E使IR发生去磷酸化是通过上调一种磷酸酶完成。在细胞系干扰PTEN后,高浓度20E抑制IR磷酸化效果减弱,单独过表达PTEN可以引起IR去磷酸化,说明高浓度20E通过上调PTEN使IR去磷酸化,但没有检测到20E诱导下PTEN与IR互作,推测PTEN间接调控IR磷酸化。研究得出如下结论:胰岛素信号通路由IR介导调节幼虫生长和发育,insulin上调控IR表达和磷酸化。高浓度20E促进Ips表达,高浓度20E通过上调PTEN表达抑制IR磷酸化。以上机制研究表明20E基于浓度促进或抑制IR的表达及磷酸化,参与胰岛素信号通路调控。创新性及意义本论文首次发现20E依赖浓度双向调控IR表达和磷酸化参与胰岛素信号通路调控,为20E和胰岛素共同调控棉铃虫生长发育提供了新的数据支持。

The regulation of glycometabolism homeostasis is vital to maintain health and development of animal and humans; however, the molecular mechanisms by which organisms regulate the glucose metabolism homeostasis from a feeding state switching to a non-feeding state are not fully understood. Using the holometabolous lepidopteran insect Helicoverpa armigera, cotton bollworm, as a model, we revealed that the steroid hormone 20-hydroxyecdysone (20E) upregulated the expression of transcription factor Kruppel-like factor (identified as Klf15) to promote macroautophagy/autophagy, apoptosis and gluconeogenesis during metamorphosis. 20E via its nuclear receptor EcR upregulated Klf15 transcription in the fat body during metamorphosis. Knockdown of Klf15 using RNA interference delayed pupation and repressed autophagy and apoptosis of larval fat body during metamorphosis. KLF15 promoted autophagic flux and transiting to apoptosis. KLF15 bound to the KLF binding site (KLF bs) in the promoter of Atg8 (autophagy-related gene 8/LC3) to upregulate Atg8 expression. Knockdown Atg8 reduced free fatty acids (FFAs), glycerol, free amino acids (FAAs) and glucose levels. However, knockdown of Klf15 accumulated FFAs, glycerol, and FAAs. Glycolysis was switched to gluconeogenesis, trehalose and glycogen synthesis were changed to degradation during metamorphosis, which were accompanied by the variation of the related genes expression. KLF15 upregulated phosphoenolpyruvate carboxykinase (Pepck) expression by binding to KLF bs in the Pepck promoter for gluconeogenesis, which utilised FFAs, glycerol, and FAAs directly or indirectly to increase glucose in the hemolymph. Taken together, 20E via KLF15 integrated autophagy and gluconeogenesis by promoting autophagy-related and gluconeogenesis-related genes expression.Author summaryGlucose is the direct substrate for energy production in animal and humans. Autophagy and gluconeogenesis are known to help organisms maintaining energy substrates; however, the mechanism of integration of autophagy and gluconeogenesis is unclear. Holometabolous insects stop feeding during metamorphosis under steroid hormone 20-hydroxyecdysone (20E) regulation, providing a good model for the study. Using lepidopteran insect Helicoverpa armigera, cotton bollworm, as a model, we revealed that Kruppel-like factor 15 (KLF15) integrated autophagy and gluconeogenesis to maintain glucose homeostasis under 20E regulation. 20E increased Klf15 expression, and KLF15 in turn promoted autophagy-related and gluconeogenesis-related genes expression during metamorphosis. Autophagy and apoptosis of the fat body provided substrates for gluconeogenesis. This work clarified the important functions and mechanisms of KLF15 in autophagy and glycometabolism reprogramming for glucose homeostasis after feeding stop during insect metamorphosis.