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食管鳞癌组织免疫细胞亚群时空分布和靶向突变抗原的免疫干预研究

项目来源

国家自然科学基金(NSFC)

项目主持人

高艳锋

项目受资助机构

郑州大学

项目编号

U1604286

立项年度

2016

立项时间

未公开

研究期限

未知 / 未知

项目级别

国家级

受资助金额

215.00万元

学科

联合基金领域-人口与健康领域

学科代码

L-L02

基金类别

联合基金项目-重点支持项目-NSFC-河南联合基金

关键词

食管鳞癌 ; 突变抗原 ; 免疫微环境 ; 免疫治疗 ; Esophageal squamous cell carcinoma ; immune microenvironment ; neoantigen ; immunotherapy

参与者

李印；石超；吴亚红；孙海波；郑燕；刘士磊；闫中义；周秀曼；王鸿飞

参与机构

河南大学；北京大学

项目标书摘要：食管癌是世界上常见的导致死亡的六大恶性肿瘤之一，太行山区是全世界高发的地区之一，并且以食管鳞癌为主，因此，研究其发病机制和防治策略具有重要意义。在早期的病因学研究结果指导下，该地区的生活环境和生活习惯得到了很大的改善，但发病率仍处于一个很高的水平。近年来外显子测序的结果表明食管鳞癌组织中存在大量的高频突变，这些突变的积累使得该地区食管癌的防控形势更加严峻。因此，研究食管鳞癌组织的微环境显得至关重要。本项目拟通过高通量测序等方法系统的研究食管鳞癌组织免疫细胞亚群的时空分布规律，发现对于食管鳞癌的发生起关键作用的免疫细胞亚群和相关分子，并且分析这些因素与病人预后之间的关系，发现重要的干预靶点；此外，通过对食管鳞癌组织高频突变靶点的分析，发现和鉴定突变抗原中潜在的免疫优势表位；最后，通过小鼠诱发食管癌模型探讨免疫干预的可行性。本项目将为食管鳞癌的诊断、预后评价和免疫干预提供重要的理论依据。

Application Abstract: Esophageal cancer is the sixth most lethal cancer worldwide.The highest incidences are in the Taihang Mountains of north-central China,in which most cases are esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Therefore,it is very important to study the development and prevention strategy.According to the research works performed during the last decades,the environmental factor and dietary habits were changed a lot,along with the decrease of the incidence ratio.But the incidence ratio is still very high.Recently,the research work by using whole-exome sequencing indicated that there are a lot of high frequency mutations in ESCC.The accumulation of these mutations make it more urgent to develop novel prevention strategies.Therefore,it is very important to elucidate the microenvironment of ESCC.In this project,we proposed to study the spatiotemporal dynamics of the intratumoral immune cells,discover the key immune cell subsets and related molecule,and analyze the relationship between these dynamics and the patients'prognosis.By these work,the immune prevention targets will be identified.We are also planned to analyze the mutation targets to identify the potential epitopes.Finally,the immunotherapy impact of these targets and epitopes will be investigated in mouse model.Our project will provide fundamental evidence to the diagnosis,prognosis evaluation and immunotherapy of ESCC.

项目受资助省

河南省

项目结题报告(全文)

食管鳞癌是中国高发的恶性肿瘤之一，解析其微环境中细胞亚群的动态变化、以及寻找潜在的治疗靶标及开发新的治疗策略至关重要。本项目通过对食管鳞癌临床样本的表达谱芯片分析，确定了主要的43种细胞亚群的动态变化，以及与病理分期、生存期和预后之间的关系。结果表明，巨噬细胞可以通过趋化因子CCL18与受体PITPNM3作用促进食管鳞癌的进展;TDO2通过激活AKT/GSK-3β/IL-8信号通路促进增殖、迁移和集落形成并促进M2巨噬细胞极化；食管鳞癌组织中激活的M1巨噬细胞可以通过分泌IL-36α,刺激NK细胞和CD8+T细胞的活化和浸润，抑制肿瘤的进展。食管鳞癌组织中存在一群CD103+组织居留CD8+T细胞,CD103+CD8+TILs与ESCC患者的整体生存呈正相关；该群细胞高表达PD-1/TIGIT/LAG-3/TIM-3等免疫检查点分子，与PD-1抗体的疗效相关。利用噬菌体展示肽库，筛选得到了针对PD-1和LAG-3的环肽阻断剂以及针对TIGIT的D肽阻断剂;CD47的靶向肽可阻断CD47与SIRPα相互作用，利用肿瘤组织中巨噬细胞的吞噬作用，与放疗联合起到协同抗肿瘤作用。通过对外显子测序数据的分析，我们针对食管鳞癌中高频突变抗原，筛选得到了针对食管鳞癌组织高频突变位点的HLA-A2限制性新表位TP53-G245S236-246 和TP53-G245S236-246,其在体内外诱导较强的免疫活性。构建了针对HLA-A2表位肽的预测方法POTN,与现有的多个方法相比，预测的准确率得到明显的提升。

  • 排序方式：
  • 1
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  • 1.CD103+ CD8+组织定居T细胞在食管鳞癌中的免疫学特性和功能研究

    • 关键词：
    • 食管鳞状细胞癌;肿瘤浸润淋巴细胞;组织定居T细胞;CD103;PD-1
    • 韩露
    • 指导老师：郑州大学 高艳锋
    • 学位论文

    食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,虽然近几年手术和新辅助放化疗在临床治疗上已经取得很大进展,但ESCC患者的5年生存率仍然很低。基于肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TILs）的免疫治疗是治疗肿瘤的有效方法之一,可能因为CD8+TIL含有不同的细胞亚群,从而导致患者的临床疗效差异较大。因此,深入探究CD8+T淋巴细胞有助于我们发现和肿瘤诊断、治疗、预后更相关的T淋巴细胞亚群。组织定居记忆（tissue-resident memory,TRM）T细胞是最近几年发现的新的淋巴细胞亚群。TRM细胞可产生效应细胞因子,对病原体感染的细胞能直接产生细胞毒性,从而参与抗肿瘤免疫反应。CD103+CD8+TRM细胞在人肿瘤组织中已有报道,但这些研究仅限于用免疫组化的方法回顾性分析TRM细胞的浸润比例和患者生存预后的关系,对其在人肿瘤组织中的特性及功能还未做进一步研究。CD103+CD8+TRM细胞在人ESCC肿瘤组织中是否存在及其在抗肿瘤免疫反应中的免疫学特性及功能至今未有研究报道。为了探索CD103+CD8+TRM细胞在ESCC中的存在情况,我们首先对TCGA数据Ⅰ-Ⅳ期ESCC的转录组测序（RNA-sequencing,RNA-Seq）结果进行分析。研究发现在ESCC肿瘤组织中,CD8A基因表达与TRM细胞标记基因-整合素αE亚单位（ITGAE,又名CD103）基因表达呈正相关性（r=0.4786）,CD8A高表达的肿瘤组织样本富集较高的ITGAE基因（P＜0.001）,并且在CD8A高达的肿瘤组织样本中,TRM细胞相关基因RUNX3、CD69、CXCR6明显高于CD8A低表达的肿瘤组织样本（P＜0.01、P＜0.0001、P＜0.0001）;进一步分析 CD9、RUNX3、CXC6与ITGAE基因的关系,发现CD69、RUNX3、CXCR6与ITGAE基因的表达也具有显著正相关性（r=0.3189、r=0.2478、r=0.5142）,并且 CD69、RUNX3、CXCR6在ITGAE基因高表达的肿瘤组织样本中表达明显高于ITGAE基因低表达的肿瘤组织样本（P＜0.01、P＜0.05、P＜0.0001）;此外,ITGAE与PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3、TIGIT等免疫检查点分子及颗粒酶B、干扰素-γ杀伤性分子对应的基因之间显著正相关（r=0.4631、r=0.4108、r=0.3869、r=0.4394、r=0.4788、r=0.5054、r=0.3682）;与ITGAE低表达的肿瘤组织相比,ITGAE高表达的肿瘤组织样本也高表达PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3和TIGIT等免疫检查点基因（P＜0.0001、P＜0.0001、P＜0.001、P＜0.001、P＜0.001）,并高表达颗粒酶B和干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）（P＜0.0001、P＜0.001）等杀伤性分子基因。以上结果表明食管鳞癌在基因水平可能存在CD103+CD8+TRM细胞,并且可能是肿瘤免疫反应中的主要效应细胞。ESCC中表达较高的CD103+CD8+TRM细胞相关基因,接下来通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）验证新鲜初治ESCC手术标本中CD103+CD8+TRM细胞的存在情况。结果显示ESCC肿瘤组织中存在CD103+CD8+TRM细胞,为（60.47±3.99）%;并且高表达PD-1、TIM-3免疫检查点,PD-1+、TIM-3+、PD-1+TIM-3+表达依次为（48.51±4.74）%、（29.09 ± 4.61）%、（39.73±5.03）%;同时也高表达CD69及低表达CD62L、CCR7,依次为（57.66±7.65）%、（2.42±0.89）%、（4.42±1.20）%,表明 CD103+CD8+T细胞有可能是一群肿瘤特异性T细胞,并具有组织定居T细胞的表型特征。为了了解化疗药物对肿瘤组织样本中CD103+CD8+TRM细胞的影响,我们进一步用FCM方法分析新辅助化疗后的ESCC患者中CD103+CD8+TRM细胞的浸润情况,结果发现新辅助化疗后ESCC肿瘤组织中CD103+CD8+T细胞的浸润比例为（65.11±6.20）%,并且高表达PD-1、TIM-3免疫检查点,PD-1+、TIM-3+、PD-1+TIM-3+表达依次为（52.40±6.31）%、（42.15±6.09）%、（52.43±5.80）%;并且,新辅助化疗后肿瘤组织中CD103+CD8+TRM细胞的比例,及 CD103+CD8+TRM 细胞上 PD-1+、TIM-3+、PD-1+TIM-3+的表达比例与初治患者相比无统计学差异（P＞0.05）,推测CD103+CD8+TRM细胞可能不受化疗药物的影响。回顾性分析2012年9月到2013年5月初治的76例ESCC癌旁组织和癌组织蜡块标本中CD103和CD8 T细胞的浸润情况,并收集患者的临床病理信息。结果显示,癌组织和癌旁组织均有CD8+和CD103+细胞浸润,但组织多色免疫荧光显示癌组织中大多数CD103+细胞共表达CD8+,显示CD103+CD8+T细胞表型,而在癌旁组织中大多数CD103+细胞不共表达CD8+,表明癌组织中CD103+细胞是T细胞来源。另外,Kaplan-Meier生存分析和Log-Rank检验结果发现CD103+和CD8+T细胞的高表达与ESCC患者较好的临床预后有关。以上结果表明CD103+CD8+TRM细胞和ESCC好的临床预后关系密切。我们进一步研究观察到,在ESCC新鲜组织标本中,与CD103-CD8+T细胞相比,CD103+CD8+T细胞Ki67增殖能力强,为（8.29±1.10）%,可分泌IFN-γ、IL-2 并且表达 CD107a,为（6.55±2.08）%、（4.24 ± 1.52）%、（11.71±1.94）%。另外,由于CD103+CD8+T细胞高表达PD-1,为了探究PD-1阻断对CD103+CD8+T细胞的影响,用anti-PD-1抗体和CD103+CD8+T细胞共孵育,发现CD103+T细胞在anti-PD-1抗体阻断后IFN-γ和 IL-2分泌能力增强,依次为（11.00±3.15）%、（5.71±1.64）%。为了更充分研究 anti-PD-1 药物对 CD103+CD8+T细胞的影响,我们运用化学致癌剂4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）饮水法建立小鼠原发食管癌模型,检测anti-PD-1抗体治疗原位食管癌小鼠后,小鼠体内CD103+CD8+T细胞的变化情况。结果显示食管癌小鼠经anti-PD-1抗体治疗后,食管组织肿瘤灶数目明显较少,对照组和anti-PD-1抗体治疗组肿瘤数目分别为4.14±0.59,2.28±0.35,有统计学差异（P＜0.05）;免疫组化结果显示食管肿瘤组织浸润的CD103+淋巴细胞（H-Score评分）在对照组和治疗组分别为0.08±0.01,0.14±0.01,两组之间有统计学差异（P＜0.05）,由此推测anti-PD-1抗体对小鼠的治疗作用有可能和CD103+T细胞的浸润增加有关。以上几部分研究对CD103+CD8+TRM细胞的存在及特性有了初步认识,最后以4-NQO诱导的食管癌小鼠为研究对象,FCM分选脾脏CD103-CD8+T细胞和CD103+CD8+T细胞,利用新一代RNA-seq技术,初步探索CD103-CD8+T细胞和CD103+CD8+T细胞的转录组差异表达基因。结果显示CD103+CD8+T细胞相对于CD103-CD8+T细胞差异表达基因的功能富集主要集中在细胞毒功能、细胞免疫反应、细胞粘附功能及相关的信号通路。这与以往的研究相吻合,表明CD103+CD8+T细胞可能参与了食管癌肿瘤组织中的免疫反应。综上所述,ESCC中存在CD103+CD8+TRM细胞,并且与患者的预后密切相关,是一群可能不受化疗药物影响,在肿瘤环境中容易被活化,容易产生应答的肿瘤反应性T细胞。并且,靶向PD-1后,CD103+CD8+TRM细胞功能有所增强,为食管癌免疫治疗的联合治疗提供有效的理论基础。

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