高级醇是决定中国白酒特征和品质的重要风味物质,对其含量的调控是白酒行业的研究热点之一。高级醇主要来源于发酵过程中酿酒酵母的代谢,因此调控酿酒酵母高级醇的代谢网络是控制白酒中高级醇含量的最直接方法。虽然酿酒酵母中高级醇的两条主要代谢通路已经较为清晰,但是代谢调控机制仍有很多不明确之处。酮酸脱羧酶在高级醇的代谢网络中起着关键性的作用,PDC1基因（编码丙酮酸脱酸酶）的缺失可以使异丁醇含量增加,异戊醇含量降低,本论文通过对酮酸脱羧酶基因敲除后所得的酿酒酵母突变株和亲本菌株进行转录组差异分析,将15个差异表达基分别以α5和α5ΔPDC1为出发菌株进行敲除,得到相应的突变株进行酒精发酵,测定其高级醇含量,研究这些差异基因的敲除对酿酒酵母高级醇生成量的影响。以α5为出发菌株,敲除CKA1基因,异丁醇和异戊醇含量较亲本菌株分别下降10.9%,12.34%;敲除MPC1基因,异丁醇含量较亲本菌株上升了 96.88%,正丙醇,异戊醇和苯乙醇含量较亲本菌株分别下降了 10%,28.2%,24.73%;敲除HMRA2基因,正丙醇,异丁醇和异戊醇含量较亲本菌株分别上升了 20.07%,25.18%,31.51%;敲除HMLALPHA2基因异丁醇含量较亲本菌株提高了 115.93%,异戊醇和苯乙醇分别降低了 30.30%,22.37%;单独敲除SIR1、SIR3基因正丙醇和异丁醇含量较亲本菌株分别有所上升。以α5APDC1为出发菌株,敲除CKA1基因,异丁醇和异戊醇含量较亲本菌株分别下降20.3%,13.25%;敲除MPC1基因,异丁醇含量较亲本菌株降低了 66.66%,正丙醇,异戊醇和苯乙醇含量较亲本菌株分别提高了了 71.22%,10.62%,15%;敲除HMRA2基因,异丁醇,异戊醇和苯乙醇含量较亲本菌株分别上升了 19.80%,14.96%,23.37%;敲除MLALPHA2基因异丁醇,异戊醇和苯乙醇含量较亲本菌株分别提高了 19.23%,28.53%,47.14%;单独敲除SIR1、SIR3基因异戊醇含量较亲本菌株均有所上升。

白酒是我国的国酒,历史悠久,深受国内消费者的喜爱。因其独特的酿造工艺以及复杂的原料,相较于其他蒸馏酒,白酒中的微量成分种类更多,且含量差异大。而白酒的风味品质与功能性正是取决于白酒中的微量成分。因此,以风味和健康双导向为指引,探究白酒中微量成分及其功能性对科学提升白酒风味品质及功能性、推动白酒现代化生产、满足消费者对白酒多样化的需求、倡导健康科学饮酒方式以及推动白酒走向世界尤显意义重大。但目前,有关白酒中风味物质及其功能性的研究还不够系统和深入。本论文以我国浓香型白酒之一的古井贡酒为主要研究对象,采用多种提取分析方法,系统解析古井贡酒中的风味物质,并探讨风味物质对古井贡酒风味形成的贡献;同时,重点关注古井贡酒风味物质中的酚类物质,采用多种方法探究古井贡酒中酚类物质的抗氧化活性以及抗炎活性,明确其在细胞内的作用机制。本论文主要研究内容与结果如下:（1）应用液液萃取法、香气萃取稀释分析法结合气相色谱-质谱仪（Gas ChromatographMass Spectrometry,GC-MS）联用、气相色谱-嗅闻仪（Gas Chromatograph-Olfactometry,GC-O）联用对古井贡酒中的风味物质进行定性分析和香气贡献评价。定性分析结果显示,共计在古井贡酒中鉴定出60种风味物质,包括21种酯类、12种酸类、8种醇类、7种酚类、3种内酯类、3种缩醛类、2种吡嗪类、2种醛酮类、2种呋喃类。香气萃取稀释分析结果显示,酯类化合物和酸类化合物的稀释因子（Flavor Dilution,FD）值较高,相较于其他类风味物质具有较强的香气表达强度,对古井贡酒风味的形成有较大贡献。其中己酸乙酯、己酸、苯丙酸乙酯的FD值高居前三,对古井贡酒风味影响较大,是古井贡酒中重要的风味物质。（2）应用直接进样法、液液萃取法结合气相色谱-火焰离子化检测器联用（Gas Chromatography-Flame Ionization Detector,GC-FID）、GC-MS对古井贡酒中的风味物质进行定量分析,并计算香气活性值（Odor Activity Value,OAV）。在此基础上对筛选出的风味物质进行香气重组和香气缺失实验,结合偏最小二乘回归法（Partial Least Squares Regression,PLSR）评价风味物质对古井贡酒风味形成的贡献以及与古井贡酒风味间的关系。定量分析结果显示,酯类、酸类、醇类风味物质是古井贡酒的骨架风味物质,在古井贡酒中的含量明显高于其他类风味物质。OAV结果显示,共计35种风味物质在5个酒样中的香气活性值均大于1,包括12种酯类、10种酸类、6种醇类、4种酚类、2种醛酮类、1种内酯类。这35种风味物质为古井贡酒中的重要风味物质。香气重组实验、香气缺失实验以及PLSR分析结果确定了风味物质与古井贡酒风味轮廓间的关系。其中,苯丙酸乙酯、丁酸乙酯、γ-壬内酯与古井贡酒甜香香气呈正相关;己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、3-甲基丁醇与古井贡酒果香香气呈正相关;苯乙醛、苯乙酸乙酯与古井贡酒花香香气呈正相关;4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、4-乙基愈创木酚与古井贡酒酚/烟熏香香气呈正相关;乙酸与古井贡酒酸味呈正相关;己酸、丁酸与古井贡酒窖香/奶酪香香气呈正相关;1-丁醇与古井贡酒醇味呈正相关;1-丁醇、2-甲基丙醇与古井贡酒粮香香气呈正相关。最终,9种风味物质被确认为古井贡酒的关键风味物质,这9种风味物质分别是己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸、丁酸、γ-壬内酯、4-甲基苯酚、苯丙酸乙酯。（3）应用DPPH、ABTS、ORAC、还原力、亚铁离子螯合能力评价方法对古井贡酒中重要的结构相似的酚类风味物质香兰素（Vanillin,VA）、4-甲基愈创木酚（4-Methylguaiacol,4-MG）、4-乙基愈创木酚（4-Ethylguaiacol,4-EG）的体外抗氧化性进行测定,应用直接进样法结合GC-MS对白酒中的香兰素、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚进行定量分析,在此基础上应用偏最小二乘回归法（PLSR）对香兰素、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚的定量结果以及酒样的DPPH、ABTS结果进行分析。结果显示,香兰素、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚具有较强的体外抗氧化性,尤其是在ABTS、ORAC、还原力实验组中表现出强于Trolox的抗氧化性。定量结果显示,4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚在103种白酒中均被检出,它们的含量范围分别为4.45±0.02~1575.41±9.70μg/L、3.76±0.13~2180.2±20.42μg/L。而香兰素只在94种白酒中检出,其含量范围为0.54±0.02~279.18±5.19μg/L。PLSR结果显示,4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚与白酒的DPPH、ABTS清除能力较相关,尤其是与ABTS清除能力相关度较高。总体来看,白酒的抗氧化性与白酒中香兰素、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚的含量呈正相关关系。（4）以AAPH诱导的HepG2细胞为细胞模型,对香兰素、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚细胞内的抗氧化活性和抗氧化机制进行探究。结果显示,香兰素、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚均能够通过激活Keap1-Nrf2信号通路,提升SOD、CAT、GPx的表达水平;提升SOD、CAT、GSH-Px的酶活力;促进GSH的生成以及提升GSH/GSSG比例;清除AAPH诱导产生的ROS;抑制MDA、GSSG的生成来改善HepG2细胞内的抗氧化体系,缓解AAPH诱导产生的氧化压力,进而维持细胞稳态。（5）以LPS诱导的THP-1细胞为细胞模型,对古井贡酒中重要的酚类风味物质4-乙基愈创木酚细胞内的抗炎活性和抗炎机制进行探究。结果显示,低（10μM）、中（100μM）、高（500μM）浓度4-乙基愈创木酚均能在一定程度上缓解由LPS诱导产生的炎症反应,4-乙基愈创木酚在THP-1细胞内表现出较强的抗炎活性。目的基因和目的蛋白的表达结果显示,4-乙基愈创木酚能够通过促进Nrf2/HO-1信号通路和AMPK/SIRT1信号通路的表达以及抑制TLR4-MAPKs-NF-κB/IκBα/AP-1信号通路表达,进而抑制炎症因子和炎性体的表达,最终起到细胞内抗炎的作用。

琅琊台白酒作为中国海洋生态白酒,是中国山东知名白酒,其工艺独特,代表性产品主要以浓香型和兼香型白酒为主。本论文综合运用现代分子感官科学技术解析了兼香型白酒（基酒和商品酒）和浓香型白酒（基酒）中风味活性化合物和健康因子,同时探究了海藏法对白酒风味的影响,对兼香型白酒的质量控制及生产工艺的改善具有重要的指导意义,也对琅琊台白酒的品质提升和白酒老熟新工艺的开发提供了理论依据。具体研究内容如下:（1）采用分子感官组学分析技术对琅琊兼香型白酒的风味成分进行了研究。首先,对顶空固相微萃取（HS-SPME）条件进行优化,确定了较优的条件为:酒样稀释至10%乙醇体积,萃取头类型为50/30μm DVB/CAR/PDMS,萃取温度30℃,萃取时间35 min;然后分别采用HS-SPME和液液萃取（LLE）方法提取了琅琊兼香型白酒（基酒和商品酒）中的香气成分,通过气相色谱-质谱-嗅闻仪联用技术（GC-O-MS）结合Osme嗅闻法分析鉴定出了56种香气活性化合物,进一步采用内标标准曲线定量方法、3-AFC法香气物质阈值测定、香气活性值（OAV）、香气重组和缺失试验的一系列现代分子感官组学技术分析确定了25种重要的香气物质,其中己酸乙酯、γ-壬内酯和二甲基三硫醚是琅琊兼香型白酒最关键的特征风味化合物。（2）采用pH调节液液萃取法结合GC-O-MS和香气萃取稀释分析法（AEDA）等方法对比分析了两种香型（浓香和琅琊香）琅琊台基酒中的风味成分。研究结果发现,从两种香型基酒中共定性了113种香气活性化合物,其中在两种基酒中稀释因子（FD）都较大的（FD≥2187）是具有浓烈果香、酒香和花香等特征的己酸乙酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、三甘醇二乙酸酯和3-苯丙酸乙酯。琅琊香基酒中部分酚类物质,以及浓香型基酒中部分酸类、吡嗪和β-大马士酮也具有较大的FD因子,它们贡献了突出的烟熏、刺激、酸、烘烤香气属性,使基酒整体呈现出一种果香浓烈、辛辣感、酸陈感、烘烤香均馥郁的风格特征。通过定量并计算香气活性值（OAV）发现,共有30种化合物（OAV＞1）为琅琊台基酒的重要香气活性物质,其中丙烯酸乙酯首次鉴定为白酒关键的香气活性物质,可能是琅琊台浓香型基酒特征风味物质之一。（3）采用感官分析法结合统计学工具解析了海藏老熟工艺对白酒风味的影响。首先,通过可接受感官评价和香气剖面分析实验发现,海藏老熟工艺能提升中华贡、小青白和海派九号三款白酒的香气愉悦感。其次,利用偏最小二乘法判别法（PLS-DA）分析了挥发性物质含量与海藏白酒香气属性的相关性,发现PLSDA可对海藏与未经海藏的酒样进行有效区分和聚类。然后,根据变量投影重要度（VIP＞1）和香气活性值（OAV＞1）共同筛选出了能有效区分两类白酒的化合物,其中影响最大的5种化合物包括戊酸乙酯、糠醛、乙醛、己醇、2-羟基-4-甲基戊酸乙酯。最后,缺失/添加感官实验结果显示,戊酸乙酯与果香相关性显著（α≤0.05）,糠醛对糠味和陈香有显著影响（α≤0.05）,乙醛对糠味和奶香有显著影响（α≤0.05）。（4）通过LLE结合GC-MS和GC×GC-MS在琅琊兼香型白酒（基酒和商品酒）以及中华贡、小青白和海派九号三款白酒中共鉴定出挥发性健康成分53种,包括酯类6种、酸类6种、酚类10种、吡嗪9种、呋喃13种、含氮5种、含硫3种、萜烯1种。含量较大的成分有乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、乙酸、己酸等,愈创木酚类和吡嗪类物质的浓度均在0.3 mg/L以下。这些健康因子对白酒的整体功效的影响有待进一步的研究。

乳酸乙酯是白酒中重要的风味物质之一,影响着白酒的口感和香味。目前很多白酒发酵后基酒存在乳酸乙酯含量偏低的问题,影响白酒品质。采用基因工程和分子生物学的手段对白酒酿造关键微生物酿酒酵母中乳酸乙酯的合成进行调控可以改善白酒的口感和香气。本研究在实验室前期研究的基础上,在2株工业酿酒酵母中对合成酯的关键脂肪酶南极假丝酵母脂肪酶B基因CALB进行多拷贝整合表达,通过不同的发酵工艺检测重组菌株中乳酸乙酯生成量的变化。以质粒pUC-19作为构建载体,选取PGK作为启动子以KanMX作为筛选标记通过多片段同源重组的方式构建过表达CALB基因的重组质粒pUC-PC。以酿酒酵母工业菌株AY12-α和α5作为出发菌株,分别以Gal80、HXT16、HO以及BAT2作为整合位点,通过Cre-loxp原理逐步去除筛选标记,实现菌株的四拷贝整合表达。以AY12-α为出发菌株构建的四拷贝重组菌株命名为SC-12、DC-12、TC-12以及QC-12。以α5为出发菌株构建的重组菌株命名为SC-15、DC-15、TC-15以及QC-15。对改造菌株提取RNA,通过Real-time PCR检测目的基因转录水平的表达量。结果表明在以AY12-α为出发菌株的重组菌株中,目的基因CALB的转录水平随着拷贝数的增加而增加,其中四拷贝菌株基因QC-12的转录水平最高,较单拷贝菌株、两拷贝菌株以及三拷贝菌株分别提高了 3.42、2.18以及1.25倍。而在以α5为出发菌株的改造菌株中,四拷贝菌株较单拷贝菌株、两拷贝菌株以及三拷贝菌株分别提高了 6.5、2.97以及1.4倍。对菌株的生长性能进行测定,结果表明基因改造对菌株的生长性能基本没有影响。对改造菌株进行白酒半固态发酵,发酵结束后通过气相色谱测定酒样中酯类和高级醇含量变化。结果表明随着拷贝数的增加,乳酸乙酯含量也随之增加,其中AY12-α基础上的改造菌株中四拷贝菌株QC-12乳酸乙酯含量最高,为109.7 mg/L,较亲本菌株提高了 33%左右。在α5基础上的改造菌株中乳酸乙酯含量和拷贝数的变化趋势也一致,其中四拷贝菌株乳酸乙酯含量最高,为174.24mg/L,较亲本菌株提高了 54%。对菌株进行高粱白酒液态发酵,发酵结果表明乳酸乙酯的含量随拷贝数的增加而增加,其中在以AY12-α为基础的改造菌株中四拷贝菌株QC-12含量最高,达到了 246.6 mg/L,较亲本菌株AY12-α提高了 41.2%。在以α5为基础的改造菌株中QC-15含量最高,达到了332.23 mg/L,较亲本菌株α5提高了26.4%。

白酒糟是高粱等农作物蒸煮加曲后经固态发酵、蒸馏后的残渣,含有较丰富的营养成分,是一种非常具有利用价值的资源。早期的研究大都集中在白酒糟的理化指标以及基本营养成分,而对其多肽组分尤其是血管紧张素转换酶（angiotensin-I-converting enzyme,ACE）抑制肽成分的研究却未见报道。世界卫生组织（world health organization,WHO）认定高血压是心血管疾病重要来源,ACE抑制肽由于其对ACE的抑制能力因而对降血压有一定效果。近年来已有在酒醅和白酒中发现ACE抑制肽的报道,故白酒糟中很可能存在较多的ACE抑制肽。因此,本课题以三大香型之一的中国浓香型白酒糟为研究对象,以ACE抑制活性为导向采用超滤、大孔树脂吸附层析和反相高效液相色谱法（reversed phase performance liquid chromatography,RP-HPLC）分离制备白酒糟中的多肽组分,并结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS）对白酒糟中的游离态和结合态多肽进行结构鉴定。采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术（ultra-performance liquid chromatography-triple-quadrupole-mass spectrometry,UPLC-QQQ-MS）定量分析了白酒糟中的ACE抑制肽,明确白酒糟中ACE抑制肽的结构以及含量分布;通过活性测定间接表征了这些多肽对抑制ACE蛋白的贡献;本研究进一步通过ProteinPilot软件结合蛋白质检索数据库Uniprot,对游离态ACE抑制肽的进行溯源分析,白酒酒糟中ACE抑制肽的研究对白酒糟的综合化利用以及提高附加值提供重要的理论参考。主要研究内容及结果如下:（1）首次采用UPLC-Q-TOF-MS结合多肽解析软件Biolynx鉴定白酒糟中的游离态ACE抑制肽,在ACE抑制活性较高的洗脱组分中鉴定出4种ACE抑制肽（含新发现的ACE抑制肽NGGPPT）。首次采用UPLC-Q-TOF-MS结合ProteinPilot软件对白酒糟中ACE抑制活性较高的洗脱组分进行多肽的微生物溯源分析,拟以浓香型白酒酿造过程中常见的功能微生物如乳酸菌、醋酸杆菌、酵母菌等为来源对象,在各洗脱组分中共鉴定出22种肽段,其中在20%乙醇洗脱组分中共鉴定出17种肽段,50%乙醇洗脱组分中鉴定出5种肽段,其中在酿酒酵母中鉴定出最多的肽段（12种）,而醋酸杆菌中所鉴定的肽段数目最少（2种）。（2）基于ACE抑制活性导向原则,本研究针对DDSG-PI的碱性蛋白酶酶解液建立超滤技术结合半制备RP-HPLC的分离纯化体系,通过测定不同分子量范围的超滤组分和RP-HPLC洗脱组分的半抑制浓度(concentration inducing 50%inhibition,IC50),筛选出活性较高的组分进行质谱鉴定。结果表明＜1 kDa的超滤组分的ACE抑制活性最高(IC50=6.75μg?m L-1),且产率高达84.18%;经RP-HPLC优化后,其中组分Ⅱ～Ⅷ的ACE抑制活性均在70%以上,其中组分Ⅵ的活性最高,为88.99%。（3）以DDSG-PI碱性蛋白酶酶解液经超滤结合RP-HPLC纯化后的Ⅱ～Ⅷ组分为研究对象,首次采用UPLC-Q-TOF-MS结合Biolynx鉴定白酒糟中的结合态的ACE抑制肽。共鉴定出6种新的ACE抑制肽,分别是NQL、AVQ、YPQ、AYLQ、VLPVLS、VLPSLN;多肽AVQ表现出最高的ACE抑制活性,其IC50值为181.19μmol?L-1。（4）首次在白酒糟中采用UPLC-QQQ-MS对目标多肽进行质谱的参数优化并定量白酒糟中的结合态ACE抑制肽,以多反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）模式完成定量质谱数据的采集,结果显示白酒糟结合态的ACE抑制肽的含量分布在0.17～16.96 mgg-1DW之间,其中多肽VLPVLS的含量最高（16.96 mgg-~1DW）;（5）酶动力学研究结果表明多肽AVQ和YPQ是ACE的非竞争性抑制剂。采用AutoDock软件将ACE抑制活性最强的多肽AVQ和YPQ与受体蛋白对接,分析其与ACE蛋白的作用位点。分子对接结果表明多肽AVQ和YPQ能与ACE蛋白的活性中心稳定结合,且Gln281,His353,Ala354,Ser355,Glu384,Lys511,His513,Tyr523残基都能对多肽与ACE蛋白有效结合产生重要的影响。

酒糟是白酒生产过程中最大的副产物,营养物质尤其是蛋白质的含量丰富,是工业中具有应用潜力的蛋白质资源,若加以合理利用可以在很大程度上提升酒糟的附加值。目前已有大量关于白酒酒糟开发再利用方面的报道,其中包括饲料、沼气、肥料、白炭黑等的开发以及对酒糟中植酸、类黑精和多肽等活性物质的提取分离,但关于白酒酒糟中醇溶蛋白的提取及应用则尚且没有较系统全面的认识和深入的研究。因此,本课题以白酒酒糟为研究对象,对酒糟进行稻壳去除后,得到“去壳干酒糟粉”（简称“酒糟粉”）,然后对酒糟粉的基本营养成分、蛋白质组分含量以及发酵过程中酒醅的蛋白质组分含量变化进行了分析;之后在此基础上采用不同提取方法对干燥前后的酒糟中的醇溶蛋白进行提取,并通过各种研究手段和物质特性分析比较了干燥处理对提取的酒糟醇溶蛋白是否具有较大影响;最后对酒糟醇溶蛋白作为水果保鲜涂膜剂的开发应用进行了初步探索,首次应用到对杨梅的涂膜保鲜,验证了白酒酒糟醇溶蛋白的保鲜性能,从而探究白酒酒糟醇溶蛋白在水果涂膜保鲜应用方面的开发潜力,为白酒酒糟再利用研究开辟一条新途径,最终实现白酒酒糟附加值的提升。主要研究内容如下:（1）对浓、清、酱三种香型的白酒酒糟进行除稻壳,得到不同香型“酒糟粉”,再对酒糟粉的基本营养成分、蛋白组分含量分布和发酵过程中酒醅的蛋白组分含量变化进行测定。基本营养成分包括粗蛋白、粗纤维、粗淀粉、粗脂肪、粗灰分、无氮浸出物和水分,其中浓、清、酱三种香型酒糟粉之间的营养成分含量差异不大,而相比于未除稻壳的酒糟,除稻壳后的酒糟粉的粗蛋白和粗纤维含量变化幅度较大,其中粗蛋白含量提高了约150 g×kg-1,而粗纤维含量则降低了约200 g×kg-1。因此通过对白酒酒糟稻壳的去除,以为后续针对酒糟蛋白展开的研究提供便利。通过Osborne分级提取,确定了浓、清、酱三种香型酒糟粉的蛋白质组分分布情况;其中浓香型和清香型酒糟粉的蛋白组分含量分布情况相似,均为醇溶蛋白＞清蛋白＞谷蛋白＞球蛋白,醇溶蛋白约占总提取蛋白的44%,清蛋白和谷蛋白次之,约占29%和23%,球蛋白分布比例最低,约为4%;而酱香型酒糟粉的蛋白组分含量分布为醇溶蛋白＞谷蛋白＞清蛋白＞球蛋白,其中醇溶蛋白约占总提取蛋白的38%,谷蛋白和清蛋白约为29%和28%,球蛋白约5%,造成酱香型酒糟粉与浓、清两种香型酒糟粉之间的差异的主要原因是制曲酿酒原料中小麦的含量配比。发酵过程中酒醅的蛋白组分含量整体均呈现上升的趋势。（2）分别采用醇碱法和乙酸法对干燥前后的白酒酒糟进行醇溶蛋白的提取,并比较醇溶蛋白的提取得率及纯度、分子量、氨基酸组成以及傅里叶红外光谱（fourier transform infrared spectrometer,FTIR）和差示扫描量热仪（differential scanning calorimetry,DSC）的测定结果。其中醇碱法的提取得率及纯度相比于乙酸法更高,最大能高约86.58%和6.36%,且醇碱法提取到的醇溶蛋白的分子量、氨基酸组成、傅里叶红外光谱和差示扫描量热仪的分析并未因酒糟的干燥而出现较大的差异,而乙酸法对于干燥前鲜酒糟的提取得率要显著高于干燥后的酒糟粉,且乙酸法提取的干燥前后的酒糟醇溶蛋白虽在结构上的差异不明显,但在氨基酸组成和热性质上均有所不同。最终结果表明醇碱法能够尽可能的保持酒糟粉和鲜酒糟中醇溶蛋白品质的一致性,更适合于白酒酒糟中醇溶蛋白的提取,从而便于后续对酒糟及其醇溶蛋白的开发再利用研究。（3）对从白酒酒糟中提取的醇溶蛋白进行开发应用,以期提高酒糟的附加值。以白酒酒糟醇溶蛋白为涂膜基质,以甘油、乳酸和聚乙二醇-400（Macrogol-400,PEG-400）为涂膜助剂,首次应用到对杨梅的常温涂膜保鲜。通过分析涂膜与未涂膜杨梅在外观、失重率、坏果率、呼吸强度、还原糖、Vc含量、可滴定酸、可溶性固形物、花色苷和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量等指标在贮藏期间的变化,从而表征白酒酒糟醇溶蛋白的保鲜性能。结果显示在常温条件下,经过醇溶蛋白涂膜保鲜剂保鲜的杨梅与未经过涂膜保鲜的普通杨梅相比,果实坏果率、失重率、呼吸强度和丙二醛含量明显受到抑制,还原糖含量被维持在一定水平,Vc、可滴定酸、可溶性固形物和花色苷含量的降低速度有所减慢,延缓了杨梅的果实衰老进程,将保鲜期延长了约2～4天。从而证实了白酒酒糟醇溶蛋白在水果涂膜保鲜上的开发应用潜力,为白酒酒糟附加值的提升提供可能。

肽是由20种天然氨基酸通过不同的排列组合所构成的一类物质,因其具有多种生物活性而受到广泛关注。酒糟是白酒蒸馏后的剩余残渣,由于白酒蒸馏原料酒醅中具有较高含量的蛋白质,并且在蒸馏过程中大部分蛋白质并没有以蒸馏的方式进入到酒体中,而是存在于白酒蒸馏后的剩余残渣酒糟中。因此,将酒糟中的蛋白质进行水解,对得到的提取液进行肽的提取、纯化、鉴定和功能性的测定,并从中筛选出功能性的肽,用于白酒或其他食品领域中来提升食品的功能性,同时对酒糟中的功能性肽的利用也提升了酒糟的附加值。本文首先通过蛋白酶对酒糟蛋白进行水解,随后采用超滤、大孔吸附树脂XAD-16、凝胶色谱、以及高效液相色谱等方法对获得的酒糟蛋白水解物进行多步骤分离纯化和制备,从而获得较高纯度的酒糟肽。分离首先通过超滤对分子量1kDa,1-3kDa的组分进行筛选;并选择两种组分中抗氧化活性较强的组分进行后续的分离和纯化,随后采用大孔吸附树脂XAD-16吸附组分中的糖和盐,得到F1和F2两个组分;并利用蛋白纯化仪依据分子量大小将组分进一步分离得到G1-G3三个组分;再对各组分进行制备,选择分离和制备纯度较高的组分进行结构鉴定;最终在G2P3和G3P1P2两个组分中鉴定出了氨基酸组成为Aa-Tyr-Ile（Leu）（AYI（L））和Asp-Arg-Glu-Ile（Leu）（DREI（L））四种多肽。随后进一步考察了四种肽的抗氧化功能和血管紧张素转换酶（Angiotensin converting enzyme,ACE）抑制活性,以及其对六种不同香型白酒中具有代表性的特征风味化合物（Characteristic aroma compounds,CACs）含量的影响。结果显示这四种肽在体外化学和细胞抗氧化实验中表现出了一定的抗氧化能力,并且同样可以在斯泼累格·多雷（Sprague Dawley,SD）大鼠体内提升谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase,GSH-Px）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD）等抗氧化酶的活力,提升还原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的含量,降低氧化型谷胱甘肽（Oxidized-form glutathione,GSSG）和丙二醛（Malondiadehyde,MDA）的含量来提升SD大鼠的抗氧化能力;肽AYI和DREI也在体外不同程度上表现出了一定的ACE抑制活性;此外,四种肽能够促进和稳定六种不同香型白酒中大部分CACs的含量。本论文以酒糟为原料,通过蛋白酶对酒糟蛋白进行水解,从而制备酒糟肽,并根据所鉴定出肽的特点研究其可能具有的生物活性。本文旨在提升酒糟的使用价值及提供酒糟处理的一个新方法,同时为将存在于酒糟中的功能性肽加入到白酒中提升白酒的健康价值作铺垫。

为了防止或减轻酿酒葡萄在生长发育过程中遭受的各种病虫危害,提高葡萄浆果的质量,化学农药被广泛使用。然而,葡萄浆果中残存的农药不仅影响葡萄酒的品质,也对环境和人类身体健康产生不利影响。本研究基于现有QuEChERS萃取法,对其进行改良,并结合超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）分析方法,研究酿酒葡萄成熟过程中农药残留的变化;分析国内外市售葡萄酒中农药残留的分布情况和不同产区葡萄酒酿造过程中农药残留的变化,以寻找酿造工艺关键控制点,为维护葡萄酒的质量安全提供指导和参考。研究主要结果如下:（1）研究国内外103款市售葡萄酒中农药残留分布。结果表明,96%的酒样中检测出了共计28种农药残留,检出率排名前三的农残是吡虫啉（76.7%）、噻虫嗪（57.3%）、三唑酮（55.3%）。国内红葡萄酒中三唑类（0.23μg/L～198.93μg/L）、苯并咪唑类（1.08μg/L～176.83μg/L）、吡啶酰胺类（7.94μg/L～170.87μg/L）农药含量较高,白葡萄酒中烟碱类（0.18μg/L～59.61μg/L）、三唑类农药（61.85μg/L～65.70 μ g/L）和苯氨基酰胺类农药（2.26μg/L～87.20μg/L）含量较高;国外红葡萄酒样中烟碱类（0.70μg/L～28.95μg/L）、三唑类农药（0.23μg/L～16.91μg/L）、苯氨基嘧啶类农药（0.39μg/L～5.95μg/L）含量较高,白葡萄酒样中烟碱类（1.79μg/L～16.45μg/L）、三唑类农残（0.3μg/L～25.42μg/L）含量较高。国内外红葡萄酒中有机氯类农残分布广泛,白葡萄酒中烟碱类、三唑类农残分布广泛。风险评估结果表明所有检测酒样对人体健康无害。（2）建立改良QuEChERS法提取酿酒葡萄中农药残留。10g（±0.05g）未破碎的固体样品中加入10 mL乙腈,超声2 min后以3700r/min的速度离心5 min,取1.8mL上清液加满QuEChERS净化管,涡旋震荡2 min,以7000r/min的速度离心3 min,取上清液经过滤膜过滤后即可测定酿酒葡萄中43种农药残留。改良QuEChERS法在0.01μg/kg～200μg/kg范围内具有良好的线性关系,决定系数在0.9963～0.9999之间,检测限（LOD）与定量限（LOQ）分别为 0.005μg/kg～0.2μg/kg 和 0.10μg/kg～10μg/kg,加标回收率除低浓度水平下的噻菌灵和三唑醇,其余为80.63%～119.71%,日内变异系数为3.91%～9.92%,日间变异系数为2.39%～9.48%。方法稳定准确可靠,满足定量分析的要求。（3）研究葡萄成熟过程中农药残留的变化。产区Ⅰ黑比诺中多菌灵、甲基硫菌灵、氰霜唑和咯菌腈在葡萄成熟过程中含量分别下降了 19.3%、82.2%、89.5%、34.8%,美乐中多菌灵、甲基硫菌灵、氰霜唑的含量分别下降了 87.9%、81.2%、100%,两种葡萄中的噻嗪酮含量均无显著变化（p>0.05）;产区Ⅱ中,黑比诺、美乐、赤霞珠中共检测出苯噻酰草胺和噻嗪酮两种农药残留,含量均无明显变化（p>0.05）;产区Ⅲ中,霞多丽中噻虫嗪和烯酰吗啉在葡萄成熟过程中含量分别下降94.1%和61.8%,苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯含量分别上升了363.9%、3609.8%,噻嗪酮含量无显著变化（p>0.05）。（4）研究葡萄酒酿造过程中农药残留的变化。结果表明,黑比诺葡萄酒中多菌灵和吡唑醚菌酯的含量分别下降了31.2%和64.4%,烯酰吗啉和嘧霉胺的含量上升了10.4%和126.9%;美乐葡萄酒中多菌灵和吡唑醚菌酯含量分别下降了53.8%和75.6%,烯酰吗啉的含量上升了67.4%;赤霞珠葡萄酒中吡虫啉、啶虫脒、嘧菌酯含量下降了90.7%、80.8%、59.1%,烯酰吗啉、嘧霉胺、吡唑醚菌酯含量上升了14.5%、10.1%、291.3%;霞多丽葡萄酒中吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、烯酰吗啉含量下降了 37.9%、50.0%、19.1%,噻虫嗪含量上升了2.07%。发酵后期农残含量易升高。（5）研究酿造工艺中农药残留的关键控制点。黑比诺与美乐葡萄酒中均检测到吡虫啉、甲基硫菌灵、啶酰菌胺、嘧霉胺、吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑6种农药残留。酿造可降低葡萄酒中大部分农残含量,黑比诺葡萄酒中农药下降了 49.0%～91.2%,美乐葡萄酒中除完全降解的甲基硫菌灵和含量上升15.7%的嘧霉胺外,其余农残含量下降了59.9%～95.1%。酿造工艺农药残留的关键控制点受葡萄品种的影响,酒精发酵为黑比诺葡萄酒工艺控制点,皮渣分离为美乐葡萄酒工艺控制点。

乙酸酯是清香型白酒的主体香气成分,是白酒重要的风味物质之一,不同香型白酒中的乙酸酯含量具有一定的差异性。为满足不同香型白酒对乙酸酯含量的不同要求,选育一系列不同乙酸酯生成能力的酿酒酵母菌株,对提高白酒的品质具有重要意义。在代谢工程中,启动子文库是调控目的基因精确表达的重要调控策略。因此,本研究通过构建PGK启动子突变文库,对醇乙酰基转移酶编码基因ATF1的表达进行精确调控,最终构建出具有不同产乙酸酯能力的酿酒酵母重组菌株。主要研究内容如下:（1）通过易错PCR获得一系列突变PGK启动子,以增强型绿色荧光蛋白EGFP为报告基因,检测突变PGKp的强度,构建了含有28个PGK突变子的PGK突变文库。PGKp突变文库的强度范围在野生型PGKp的10%至141%之间。利用β-半乳糖苷酶lacZ基因作为第二报告基因,检测了 8、17、18、22、25、27、28号PGK突变启动子的强度,证实了 EGFP作为第一报告基因的准确性,同时确定了 7个PGKp突变子的强度依次为:8<17<18<22<野生型<25<27<28。（2）将8、17、18、22、25、27、28号PGK突变启动子进行测序,确定了突变位点,同时将这7个PGKp整合到pUC-19载体质粒上进行启动子的保存。通过生物信息学方法确定了 PGKp的上游激活序列和部分突变转录调控元件（TATA-Box、Gcr1p、Rap1p、Abf1p、Reb1p）的具体位置。位于启动子的元件上的碱基突变可能是启动子强度变化的原因之一。（3）利用8、17、18、22、25、27、28号PGK突变启动子和野生型PGKp,构建敲除BAT2基因并过表达ATF1基因的酿酒酵母突变株a45-A8、a45-A17、a45-A18、a45-A22、a45-A25、a45-A27、a45-A28和a45-AWT,发酵所得的蒸馏酒样中乙酸乙酯的产量分别为 18.64 mg/L、34.67 mg/L、118.88 mg/L、179.57 mg/L、254.64 mg/L、146.73 mg/L、270.24 mg/L、305.68 mg/L。测定了 ATF1基因的 mRNA 水平及醇乙酰基转移酶（AATase）的酶活力。结果显示,不同强度的PCK启动子可以精确调控ATF1的表达和乙酸酯的生成。研究表明,PGK启动子突变文库的强度变化范围较广,有着良好的应用前景。利用文库中的PGKp构建的重组菌株能够生成不同梯度含量的乙酸酯,从转录水平和酶活水平验证了突变PGKp对ATF1基因的精确调控能力。这些重组菌株能够满足不同风格、品牌白酒对不同含量乙酸酯的要求,达到了改善白酒风味和品质的目的。

生物胺是广泛存在于葡萄酒等发酵食品中的含氮化合物,对人体血管和神经系统有直接或间接的影响。高浓度的生物胺会引起恶心、头痛、呼吸窘迫、心悸、皮疹和血压的变化,从而影响葡萄酒的饮用安全性。葡萄酒中生物胺常规的HPLC分析方法涉及多种提取溶剂的使用以及反复的提取-干燥-复溶过程,有机试剂消耗量大,提取时间长。本研究通过单因素实验,对葡萄酒中8种生物胺（色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺）的HPLC分析方法进行优化,并在葡萄酒发酵过程中对其生物胺含量进行监测,寻找其工艺控制关键点。结果表明:（1）优化后的葡萄酒生物胺检测方法,在0.1-50 mg/L浓度范围内,各目标生物胺的线性较好（R^2 为0.9983-0.9999）,日内和日间稳定性分别小于4.86%和5.22%,检测限为0.001-0.050 mg/L,定量限为0.005-0.167 mg/L,样品在1.0、5.0、10.0 mg/L三种浓度下的加标回收率为73.02-111.61%。该方法简单、快速、灵敏、高效、可靠,可用于葡萄酒中生物胺的检测与定量。（2）腐胺、酪胺、2-苯乙胺是葡萄酒中主要生物胺,组胺、色胺、尸胺次之,亚精胺、精胺含量最低。红葡萄酒中生物胺总含量（2.37-87.05 mg/L）远远高于白葡萄酒（1.81-8.70 mg/L）。国外葡萄酒中生物胺含量及种类分布较国内葡萄酒集中,国内葡萄酒分布广泛。（3）对葡萄酒发酵过程中生物胺含量进行监测,结果表明,在玫瑰香、小味儿多和贵人香葡萄发酵过程中,2-苯乙胺、腐胺含量增加,尸胺、亚精胺含量降低,发酵过程中未检出精胺,所酿葡萄酒中含量最高的生物胺是腐胺。（4）不同工艺处理对葡萄酒酿造过程中8种生物胺的影响,因葡萄品种、生物胺种类的不同而不同。苹果酸乳酸发酵、酒精发酵、加糖为玫瑰香葡萄酒发酵过程中生物胺的工艺关键控制点;加糖处理、酒精发酵、添加焦磷酸钾和果胶酶为小味儿多葡萄酒发酵过程中生物胺的工艺关键控制点;酒精发酵、压榨为贵人香葡萄发酵过程中生物胺的工艺关键控制点。因此,本研究为提高我国葡萄酒安全性提供科学依据和参考,为消费者提供安全健康的葡萄酒产品,对规范葡萄酒行业生产秩序、保护我国葡萄酒消费者的健康及促进葡萄酒行业的持续发展意义重大。