目的:应用超高效液相色谱联用四级杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF/MS）结合UNIFI数据处理平台对牛膝三萜皂苷进行快速定性分析;测定牛膝三萜皂苷在肠道菌群、肝微粒体以及血浆中的代谢产物,探讨其体内外代谢特征,为牛膝三萜皂苷药效物质基础的研究提供实验依据。方法:建立牛膝三萜皂苷UNIFI数据库;首先探究4个三萜皂苷对照品的特征离子并总结三萜皂苷的质谱裂解规律;然后通过UPLC-Q-TOF/MSE在负离子模式下对牛膝供试品进行分析,并将采集的MSE数据导入UNIFI数据处理平台,最后通过预设参数对各离子峰进行识别,并与已建立的目标数据库自动匹配;建立大鼠肠道菌群孵育系统,测定3个代表性化合物在肠道菌群的代谢物以及牛膝三萜皂苷在不同孵育时间的代谢物,来探究牛膝三萜皂苷在肠道菌群中的代谢物以及代谢特征;建立大鼠体外肝微粒孵育系统,探究牛膝三萜皂苷在肝微粒体中的转化规律;通过进样分析给药大鼠血浆,探究牛膝三萜皂苷在血浆中的代谢规律。结果:1.共分离、鉴定了40种三萜类皂苷成分,其中在齐墩果酸母核上C3或C28仅有一个取代基的化合物13种,C3和C28位均有取代基的化合物25种,另有其它母核的化合物2种。2.构建大鼠肠道菌群孵育系统,通过UPLC-Q-TOF/MSE结合UNIFI数据处理平台测定分析牛膝三萜皂苷肠道菌群孵育液,鉴定出39种代谢产物,主要代谢反应有脱糖基、脱氢、氧化和糖基化。3.构建大鼠肝微粒体孵育系统,通过UPLC-Q-TOF/MSE结合UNIFI数据处理平台,共检测出牛膝三萜皂苷在肝微粒体孵育液中26个代谢产物,代谢物主要通过氧化、脱氢等代谢反应产生。4.采集灌胃大鼠血浆,共检测到大鼠血浆中21个代谢产物,代谢物主要发生双氧化、脱氢等代谢反应。结论:本研究通过UPLC-Q-TOF/MS结合UNIFI数据处理平台可快速鉴别牛膝三萜皂苷类成分以及在肠道菌群、肝微粒体和血浆中的代谢物,初步阐明了牛膝三萜皂苷的化学组成以及体内外代谢特征,为其后续的物质基础研究提供实验依据。

背景:类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种临床多特征表现的复杂疾病,而血管新生贯穿始终,其中血管内皮细胞（Vascular endothelial cells,VECs）的异常活化被认为是RA发生发展的关键环节。在血管新生发病机制研究中,血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）和1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine 1-phosphate,S1P）信号途径获得了越来越多的关注。然而,既往研究多重视VEGF/VEGFR2和S1P/S1PR1信号途径单独的促血管新生作用,未考虑到两者间潜在联系,导致目前对RA血管新生信号途径之间的关系知之甚少,亟待进一步探索。中医学认为,RA属“痹症”,也属“络病”,是“新病入络”的代表病证,应采用从“络”辨治的中医思想来治疗RA。此外,中医对络脉逐层分级与现代医学对微血管细化分支具有一定的相似度,络脉理论和血管生成理论具有高度的统一性,中医提出的RA络病与现代医学中的血管新生密切相关。中药栀子具有泻火除烦、清热祛湿、凉血解毒等功效,栀子苷（Geniposide,GE）是从栀子的干燥成熟果实中提取纯化得到的主要活性成分,具有抗RA、抗炎和免疫调节等多种药理作用。课题组前期已经证实GE口服具有明显的抗RA炎症作用;但GE是否具有抗血管新生作用?及其抗RA血管新生作用的机制是什么?还需进一步探索。本课题在既往工作基础上,从体内外两个方面建立多个实验模型研究GE、血管新生以及RA之间的关联性,并利用微量热泳动仪实验（MST）和分子对接实验验证了GE抗RA作用的可能靶点,探究了该靶点与RA的关系并阐明其在VEGF/VEGFR2和S1P/S1PR1信号途径之间的联系,为GE抗RA“从络辨治”提供创新性探索。目的:1.探讨VECs生物学功能异常与VEGF/VEGFR2和S1P/S1PR1信号途径之间的关系;揭示VEGF通过VEGFR2/PKC/ERK1/2途径诱导Sph K1转位,继而激活S1P/S1PR1途径介导VECs生物学功能改变,触发RA血管新生的新机制。2.探讨GE靶向结合Sph K1,揭示GE对Sph K1激酶活性和转位行为的调控,阐明GE靶向抑制Sph K1,阻断VEGF/VEGFR2和S1P/S1PR1信号途径间联系,抑制RA血管新生新机制。方法:1.建立AA大鼠模型,随机分为AA组、GE组和阳性药MTX组,同时以正常组作为对照,对各组大鼠关节肿胀度、关节炎指数、运动能力以及类风湿因子（rheumatoid factor,RF）指标进行模型评价;HE染色观察滑膜组织病理,ELISA法检测血清中VEGF、Ang-2、AS和ES水平,免疫组化和蛋白质印迹实验用于检测滑膜组织中Vimentin、CD31、VEGF、p-VEGFR2、Sph K1、p-Sph K1和S1PR1的表达,相关性分析法分析VEGF、p-VEGFR2、Sph K1、p-Sph K1、S1P以及S1PR1与CD31表达水平之间的联系。2.建立VEGF诱导HUVECs血管新生模型,同时以p-VEGFR2和细胞内外S1P的表达作为模型评价指标;CCK-8、Edu和LDH实验检测HUVECs活性以及药物毒性,细胞划痕和Transwell小室实验检测HUVECs水平迁移、竖直迁移以及通透性能力,细胞粘附试剂盒检测HUVECs粘附性能力,细胞成管实验检测HUVECs管腔形成能力,大鼠主动脉环实验检测VECs出芽能力,ELISA法检测HUVECs分泌S1P能力,WB和RT-q PCR分别检测VEGF诱导VEGFR2/PKC/ERK1/2/Sph K信号途径相关蛋白和m RNA的表达以及Sph K1胞质和胞膜的分布,激光共聚焦和免疫共沉淀检测p-ERK1/2和Sph K1的共表达。3.建立Sph K1沉默的HUVECs细胞和C57BL/6小鼠模型,同时以HUVECs和滑膜组织中Sph K1的蛋白和m RNA表达水平作为模型评价指标;CCK-8、Edu和LDH实验检测Sph K1沉默对VEGF诱导HUVECs活性以及药物毒性,细胞划痕和Transwell小室实验检测Sph K1沉默对VEGF诱导HUVECs水平迁移、竖直迁移以及通透性能力,细胞粘附试剂盒检测Sph K1沉默对VEGF诱导HUVECs粘附性能力,细胞成管实验检测Sph K1沉默对VEGF诱导HUVECs管腔形成能力,ELISA法检测Sph K1沉默对VEGF诱导HUVECs分泌S1P能力;大鼠主动脉环实验检测Sph K1沉默对VEGF诱导VECs出芽能力,HE染色观察基质胶栓病理,免疫组化检测CD31表达水平,免疫荧光检测周细胞覆盖率、基底膜形成、血管渗透性以及纤维蛋白原堆积。4.建立Sph K1磷酸化单点突变质粒转染的HEK293模型,在G418硫酸盐溶液中药筛7天,同时以HEK293中Sph K1的蛋白和m RNA表达水平作为模型评价指标;WB和ELISA法检测Sph K1胞质和胞膜的分布以及Sph K1、p-Sph K1、S1PR1蛋白和S1P细胞因子的表达。5.GE靶向结合Sph K1研究:MST检测GE和Sph K1蛋白的结合能力;Auto Dock Vina分子模拟检测GE与Sph K1可能结合靶点;CETSA检测细胞内GE与Sph K1的结合情况;ADP-GloTM激酶检测试剂盒检测GE对Sph K1激酶活性抑制情况。结果:1.VEGF/VEGFR2信号和S1P/S1PR1信号介导RA血管新生的体内验证及GE的干预在AA大鼠和RA患者滑膜组织中发现新生血管的存在,同时伴随VEGF/VEGFR2和S1P/S1PR1信号途径异常活化,经GE（60 mg/kg/days）和MTX（0.5 mg/kg/3 days）整体给药治疗均能够有效降低AA大鼠关节肿胀度、关节炎指数以及RF水平,恢复大鼠运动能力;均可以不同程度的恢复大鼠血清中促血管生成因子VEGF、Ang-2和抑血管生成因子AS、ES的平衡;均可以不同程度的改善大鼠滑膜病理情况;均可以抑制VEGF/VEGFR2和S1P/S1PR1信号途径异常活化;进一步研究发现,Sph K1在RA滑膜组织中异常表达,且与滑膜血管新生密不可分;以上结果表明,RA滑膜组织存在血管新生,GE能够有效缓解AA症状。2.VEGF触发VECs生物学功能改变及作用机制探究体外构建VEGF（20 ng/m L）诱导HUVECs模型,用VEGFR2抑制剂（Apatinib,5μM）、PKC抑制剂（Go 6983,5μM）、ERK1/2抑制剂（SCH772984,1μM）和Sph K1抑制剂（PF-543,5μM）分别干预24 h,发现各组抑制剂均可以不同程度抑制VEGF诱导的HUVECs增殖、迁移、通透、粘附、成管、芽生能力、以及S1P分泌功能的改变。进一步研究发现,VEGF能够通过VEGFR2/PKC/ERK1/2信号介导Sph K1的活化,促进其转位,诱导S1P/S1PR1信号的激活,参与HUVECs生物学功能的改变。对VEGF诱导Sph K1活化机制研究,结果显示HUVECs细胞内p-ERK1/2和Sph K1之间存在直接作用,在VEGF的刺激作用下,p-ERK1/2和Sph K1之间的作用被显著增强,经Apatinib,Go 6983,SCH772984以及PF-543干预后,p-ERK1/2和Sph K1之间的作用被不同程度降低。以上结果表明,VEGF诱导Sph K1转位参与VECs生物学功能改变。3.Sph K1基因沉默对VEGF诱导血管新生的体内外探究以及Sph K1磷酸化位点活性的探寻用Sph K1-si RNA（20 n M）体外转染HUVECs,观察Sph K1沉默对VEGF诱导VECs生物学功能的影响,结果显示Sph K1沉默能够有效缓解VEGF诱导HUVECs增殖、迁移、通透、粘附、成管以及S1P分泌功能的改变;用Sph K1-si RNA（5μg/animal）体内注射C57BL/6小鼠,观察Sph K1沉默对VEGF诱导体内血管新生的影响,结果显示Sph K1沉默能够明显改变VEGF诱导新生血管的结构（周细胞覆盖率和基底膜形成）和功能（渗透性和纤维蛋白原堆积）;用Sph K1磷酸化单点突变质粒（5μg/每孔）体外转染HEK293,观察Sph K1不同磷酸化位点对VEGF诱导Sph K1活化机制的影响,结果显示Sph K1-Ser225磷酸化位点可以影响VEGF诱导Sph K1的转位和S1P/S1PR1信号的激活,Sph K1-Thr193磷酸化位点可能通过影响VEGF诱导Sph K1-Ser225的磷酸化,进而影响其细胞膜分布和S1P/S1PR1信号的激活。以上结果表明,Sph K1-Ser225位点对Sph K1转位和S1P/S1PR1信号激活有重要影响。4.GE靶向抑制VEGF诱导的Sph K1转位,缓解RA血管新生用GE（25,50,100μmol/L）干预VEGF诱导的HUVECs,结果显示GE能够通过调控Sph K1的过度转位,缓解VEGF诱导的HUVECs增殖、迁移、通透、粘附、成管、芽生能力、以及S1P分泌功能的改变;用GE（120 mg/kg）干预AA小鼠体内VEGF诱导的血管新生,结果显示GE能够明显改变VEGF诱导新生血管的结构（周细胞覆盖率和基底膜形成）和功能（渗透性和纤维蛋白原堆积）;在GE靶向结合Sph K1的研究中,MST实验结果显示GE和Sph K1的解离常数（Kd）为34.26±0.97μM,结果表明GE与Sph K1蛋白存在直接结合。Auto Dock Vina分子对接模拟结果显示GE和Sph K1的结合能量为-8.3 kcal/mol,结合位置为Sph K1的激酶催化结构域,结合位点分别为Asn-22,Ser-79,Asp-81,Gly-82,Glu-86,Ala-110和Gly-343。CESTA实验结果显示GE能够与内源性的Sph K1蛋白结合,增加其热稳定性,但是GE不能与A22G-S79A-A81G-G82A-G86A-A110G-G343A位点突变的Sph K1蛋白的结合。ADP-GloTM激酶检测结果显示GE在25μM ATP+ADP浓度的反应体系下,对125ng Sph K1蛋白的IC50为3.856μM。以上结果全部证实GE能够通过靶向抑制VEGF诱导的Sph K1转位,缓解RA血管新生。结论:1.RA是一种血管新生依赖性疾病,关节滑膜组织存在VEGF/VEGFR2和S1P/S1PR1促血管新生信号途径的异常激活。2.VEGF通过VEGFR2/PKC/ERK1/2信号途径诱导Sph K1转位,继而激活S1P/S1PR1途径参与VECs生物学功能改变;GE给药可下调Sph K1的表达,减弱Sph K1的转位,抑制S1P/S1PR1信号途径的激活,从而缓解VEGF诱导的VECs生物学功能改变。3.VEGF诱导Sph K1 Ser225位点的磷酸化对Sph K1的转位和S1P/S1PR1信号的激活具有重要影响。4.GE能够直接靶向抑制Sph K1激酶活性,下调Sph K1的转位,GE与Sph K1作用的关键活性位点可能存在于Asn-22,Ser-79,Asp-81,Gly-82,Glu-86,Ala-110和Gly-343之中。GE抑制Sph K1转位的分子机制可能参与缓解VEGF诱导的VECs生物学功能改变。

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性、难治性自身免疫性疾病。关节局部有滑膜异常的炎性增生、微血管的新生以及血管翳的形成,最终造成关节软骨和骨的侵蚀,关节的破坏是其主要病理特征。到目前为止,RA的确切病因和发病机制尚不清楚,研究表明与感染及遗传等多种复杂因素有关。很多研究发现不论什么原因诱发的RA,基本上都与关节滑膜微环境失衡有关。成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）和血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VEC）作为微环境的重要参与者,它们的改变与关节滑膜微环境失衡密切相关。炎症在RA的发生发展过程中起到重要作用,关节炎性微环境的持续存在可促进RA的发生发展。慢性炎症的滑膜微环境中,充斥大量的炎性细胞因子,如1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate,S1P）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、白介素（interleukin,IL）-1等,它们对RA的发生发展具有重要的作用。VEE为FLS提供细胞因子、氧和营养物质,而VEC大量分泌S1P,并激活FLS中S1P下游信号通路,是影响RA的重要因素之一。有研究证实S1P与1-磷酸鞘氨醇受体（sphingosine-1-phosphate receptors,S1PRs）结合后,参与FLS的炎性细胞因子分泌、增殖与凋亡,进而调控RA的发生发展。基于炎性微环境中VEC和FLS的研究现状及其在RA发生发展中的潜在意义,本研究拟建立TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical venous endothelial cell,HUVEC）炎症损伤模型,检测HUVEC中S1P的含量的变化,并用HUVEC条件培养基培养类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis fibroblasts,RASFs）,探究S1P是否是VEC对FLS作用的关键分子。阐明S1P参与VEC对FLS作用的可能分子机制。并进一步探讨GE干预HUVEC的可能作用靶点,调控S1P信号通路的级联反应,发挥抗炎免疫作用。为中药抗炎免疫有效成分防治RA提供新靶点及策略,也为中药有效成分的研究与应用提供更多的实验依据。1目的观察S1P在TNF-α诱导HUVEC炎症模型中的表达变化情况,HUVEC条件培养基对RASFs增殖及细胞因子分泌等功能的影响,探讨炎性细胞因子通过S1P信号转导在VEC对RASFs作用中的分子机制;观察GE给药后,是否能降低HUVEC中S1P的表达水平,抑制RASFs中S1P下游Ras-Erk1/2信号通路,阐明GE作用靶点和抗炎免疫的作用机理。2方法体外培养HUVEC,建立TNF-α诱导HUVEC炎症损伤模型。ELISA法检测HUVEC生成和分泌S1P含量的变化;为探讨S1P在HUVEC中是如何产生以及GE的作用靶点,用RT-qPCR和Western blotting法检测HUVEC中Erk1/2和鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1,SphK1）基因和蛋白表达水平以及蛋白磷酸化水平。为探讨S1P信号转导在VEC对RASFs作用中的分子机制,采用不同组别的HUVEC条件培养基培养RASFs,CCK-8法和ELISA法分别检测HUVEC条件培养基对RASFs的增殖活性和细胞因子分泌的影响;用RT-qPCR和Western blot法测定RASFs中Ras-Erk1/2信号通路中关键基因和关键蛋白的表达。3结果3.1 GE对TNF-α诱导HUVEC分泌S1P水平的影响不同组别细胞内和细胞外S1P含量变化趋势一致,与空白组相比,TNF-α组中S1P含量明显升高（P＜0.01）;GE给药组中S1P含量呈下降趋势,且100μg/mL作用最为显著。3.2 GE对TNF-α诱导HUVEC中P-SphK1胞质与胞膜表达的影响TNF-α组P-SphK1胞质和胞膜蛋白表达量相对于对照组明显升高（P＜0.01）,提示TNF-α诱导P-SphK1蛋白由细胞质向细胞膜转移,促进S1P的生成;与TNF-α组比较,不同浓度的GE、FTY-720（1μM）和SCH772984（1μM）处理细胞后,P-SphK1胞质和胞膜蛋白表达量均显著降低（P＜0.01）。3.3 GE对TNF-α诱导HUVEC中P-Erk1/2与SphK1的共表达影响正常情况下,HUVEC中P-Erk1/2与SphK1有共表达;与空白对照组相比,TNF-α组中P-Erk1/2与SphK1的共表达显著增加（P＜0.01）;与TNF-α组比较,不同浓度GE组中P-Erk1/2与SphK1的共表达均降低（P＜0.01）,与FTY-720组、SCH772984组作用相一致。3.4 GE对TNF-α诱导HUVEC中S1P信号通路关键基因表达的影响TNF-α组HUVEC中Erk1/2mRNA和SphK1mRNA的表达相对于对照组HUVEC显著升高（P＜0.01）;与TNF-α组比较,经GE给药处理后,GE中、高剂量组均显著降低了Erk1/2mRNA和SphK1mRNA的表达量（P＜0.01）,并呈现剂量相关性。FTY-720组、SCH772984组与GE组具有相似的作用。3.5 GE对TNF-α诱导HUVEC中S1P信号通路关键蛋白分子的表达及活化的影响与空白对照组相比,TNF-α组中P-Erk1/2、P-SphK1和SphK1蛋白显著高表达（P＜0.01）。与TNF-α组比较,不同浓度GE作用后,P-Erk1/2、P-SphK1和SphK1的蛋白表达量与TNF-α组相比均降低（P＜0.05）,与FTY-720组、SCH772984组作用相一致。3.6 HUVEC条件培养基对RASFs增殖的影响TNF-α条件培养基组中RASFs的增殖水平,与对照条件培养基组相比明显上升（P＜0.01）;不同浓度GE给药的条件培养基组中RASFs的增殖水平呈不同程度的下降,且50和100μg/mL GE组条件培养基下调更为显著（P＜0.01）;FTY-720组条件培养基和SCH772984组条件培养基亦可显著抑制RASFs的细胞增殖能力（P＜0.01）,具有统计学意义。3.7 HUVEC条件培养基对RASFs中IL-1β、IL-6、IL-10和TGF-β1分泌水平的影响与空白对照条件培养基组相比,TNF-α条件培养基组RASFs中促炎细胞因子IL-1β和IL-6的分泌水平明显升高,抗炎细胞因子TGF-β1和IL-10的分泌水平显著降低（P＜0.01）;与TNF-α条件培养基组比较,GE条件培养基组RASFs中的IL-1β和IL-6水平显著下降（P＜0.05）,TGF-β1和IL-10水平明显上升（P＜0.05）;FTY-720条件培养基组、SCH772984条件培养基组与GE条件培养基组作用相一致。3.8 HUVEC条件培养基对RASFs中Ras-Erk1/2信号通路关键基因的影响TNF-α条件培养基组RASFs中S1PR1mRNA、RasmRNA和Erk1/2mRNA的表达相对于对照条件培养基组显著升高（P＜0.01）;不同浓度GE条件培养基均显著降低了S1PR1mRNA、RasmRNA和Erk1/2mRNA的表达量（P＜0.01）,与FTY-720条件培养基组、SCH772984条件培养基组具有相似的作用。3.9 HUVEC条件培养基对RASFs中Ras-Erk1/2信号通路关键蛋白分子的影响与空白对照条件培养基组相比,TNF-α条件培养基组RASFs中S1PR1、Ras和P-Erk1/2蛋白显著高表达（P＜0.01）。不同浓度GE条件培养基组RASFs中S1PR1、Ras和P-Erk1/2的蛋白表达量,与TNF-α条件培养基组相比均降低（P＜0.05）;FTY-720条件培养基组、SCH772984条件培养基组与GE条件培养基组作用相一致。4结论1.炎性细胞因子TNF-α诱导HUVEC中Erk1/2发生磷酸化,活化后的Erk1/2进一步激活SphK1,从而增加S1P生成。这些作用可被加入的GE消除。2.GE抑制HUVEC中P-Erk1/2和SphK1蛋白的表达,从而减少S1P的产生,与P-Erk1/2抑制剂SCH772984和SphK1抑制剂FTY720作用相似,提示GE的作用靶点可能是P-Erk1/2和SphK1。3.GE作用血管内皮细胞的条件培养基抑制FLS增殖和调节FLS中促炎细胞因子和抑炎细胞因子的相对平衡,是与GE抑制SphK1/S1P/S1PR1及其下游Ras-Erk1/2信号通路有关。

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫疾病。其异常增殖的关节滑膜成纤维样细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLSs）可分泌多种炎性因子参与关节炎症反应。1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine 1-phosphate,S1P）,作为一种重要的炎性因子,可与1-磷酸鞘氨醇受体（S1P receptors,S1PRs）结合,通过偶联G蛋白介导下游信号通路参与炎症反应。其中S1PR1/2/3广泛表达于各类细胞中,在细胞增殖、血管新生、内皮屏障功能等方面发挥重要作用。而S1P能够刺激Gαi/Gαs介导的相关下游信号通路,影响环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate,c AMP）的表达水平,对炎症起到重要调控作用。但S1P/S1PR1/2/3是否通过介导Gαi/Gαs转换,干预FLSs生物学功能尚未有报道研究。栀子苷（Geniposide,GE）作为抗炎候选药物具有良好的开发前景。课题组前期研究发现,GE通过抑制S1P/S1PR1及其介导的下游信号通路,恢复促/抑炎因子的动态平衡,抑制FLSs异常增殖和血管翳生成,发挥治疗RA的作用。基于前期良好的实验基础以及S1P/S1PRs的研究现状。本研究拟建立S1P诱导的体外RA患者滑膜细胞MH7A炎症损伤模型,探讨GE是否通过抑制S1PR1/2/3,调节偶联的Gαi/Gαs表达水平,恢复Gαi/Gαs的动态平衡,从而抑制FLSs异常增殖。为揭示S1PRs偶联Gα蛋白参与RA关节炎症过程及GE作用机理提供重要依据,也为治疗RA的中药有效成分药物的筛选提供新思路。目的:阐明S1P-S1PR1/2/3-Gαi/Gαs信号通路对MH7A生物学功能的影响,揭示S1PR1/2/3调节Gαi/Gαs转换发生的机制,进一步探讨GE介导S1P/S1PR1/2/3调节Gαi/Gαs转换对MH7A生物学功能的影响。方法:体外培养MH7A,建立S1P诱导的MH7A炎症损伤模型。为阐明S1P通过S1PR1/2/3调节Gαi/Gαs的转换机制,探讨选择性抑制S1PR1、S1PR2、S1PR3、Gαi、激活Gαs等工具药对MH7A生物学功能的影响。为进一步探讨GE对MH7A生物学功能的影响及其介导S1PR1/2/3调节Gαi/Gαs转换发生机制,观察GE（25、50、100μmol/L）干预,选择性抑制S1PR1/3、S1PR2、Gαi、激活Gαs表达对MH7A生物学功能的影响。采用CCK-8、划痕实验、Transwell和流式细胞术等方法检测各组MH7A增殖活性、迁移和侵袭能力、凋亡水平。ELISA法检测MH7A中PGE2、IL-1β、IL-6、IL-8、TGF-β1、c AMP分泌水平。免疫荧光法检测S1PR1/2/3、Gαi/Gαs蛋白在MH7A中定位和偶联情况。RT-q PCR和Western blot法检测MH7A中S1PR1/2/3偶联Gαi/Gαs转换及其下游信号通路中关键基因和蛋白的表达水平。结果:1 S1P诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞MH7A体外炎症损伤模型的建立S1P（0.1-10μmol/L）可在12、24、48 h促进MH7A增殖,S1P刺激后MH7A中c AMP分泌水平和c AMP m RNA水平也明显下调,其中5μmol/L作用24 h更为显著。免疫荧光和Western blot法结果显示S1P（5μmol/L）刺激MH7A后,显著上调S1PR1/2/3蛋白表达水平。因此,S1P（5μmol/L）作用24 h作为后续实验最适造模条件。2 S1P通过S1PR1/2/3偶联Gαi/Gαs转换对MH7A生物学功能的影响用S1PR1抑制剂（W146）、S1PR2抑制剂（JTE-013）、S1PR3抑制剂（CAY10444）,Gαi抑制剂（PTX）和Gαs激活剂（CTX）等工具药物,干预S1P诱导的MH7A中S1PR1/2/3、Gαi/Gαs的表达,发现除抑制S1PR2仅抑制MH7A侵袭能力外,其他各组均显著抑制MH7A增殖、迁移和侵袭能力,并促进其凋亡。各组MH7A中IL-1β、PGE2胞外分泌水平均显著降低,而胞内c AMP含量和c AMP m RNA水平明显上升。除了抑制S1PR2后,MH7A中Gαs蛋白不上调外,其他各组用药均下调MH7A中Gαi蛋白表达水平,上调Gαs蛋白表达水平。而S1PR1/3作用相似,后期实验将放在一起研究。3栀子苷介导S1PR1/2/3偶联Gαi/Gαs转换对MH7A生物学功能的影响用GE（25、50、100μmol/L）,选择性S1PR1/3双抑制剂（VPC 23019）、S1PR2抑制剂（JTE-013）,Gαi抑制剂（PTX）和Gαs激活剂（CTX）等药物,干预S1P诱导的MH7A。结果显示,GE可通过抑制S1PR1/3、Gαi,激活Gαs基因和蛋白表达水平,偶联介导Gαi/Gαs转换,恢复Gαi/Gαs的动态平衡,调节下游信号通路,下调p-Erk1/2、增殖标志蛋白Ki67和抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平,上调促凋亡蛋白caspase-3、Bax表达水平,抑制促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8和炎症介质PGE2分泌水平,上调抑炎因子TGF-β1和c AMP分泌水平,恢复促/抑炎因子平衡,进而抑制S1P诱导的MH7A增殖、迁移和侵袭,促进凋亡。此外,GE也可抑制MH7A中S1PR2-Gαi信号通路激活,抑制S1PR2激活介导的相关炎症反应。结论:S1P通过激活MH7A中S1PR1/3,上调Gαi蛋白表达水平,下调Gαs蛋白表达水平,导致Gαi/Gαs失衡,破坏促/抑炎因子的动态平衡,促进MH7A异常增殖。GE主要通过抑制S1PR1/3,介导Gαi-Gαs转换,恢复Gαi/Gαs的动态平衡,调节下游信号通路,下调促增殖蛋白、抑凋亡蛋白表达水平,上调促凋亡蛋白表达水平,恢复促/抑炎因子的平衡,抑制MH7A异常增殖,从而发挥抗炎免疫调节作用。

1目的探讨在佐剂性关节炎（adjuvant arthritis,AA）大鼠模型中PHDs/p VHL/HIF-α途径信号转导变化及栀子苷（geniposide,GE）的治疗作用;探究GE对缺氧诱导MH7A中PHDs/p VHL/HIF-α信号通路的具体作用机制及对细胞增殖的影响。2方法1)体内实验:成功建立AA大鼠模型,随机分为5组,分别以等体积生理盐水、GE（30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg）、甲氨蝶呤（0.5mg/kg）灌胃给药7d。从足肿胀度,关节炎指数,全身表现评分三方面评价各组关节炎症程度;HE染色检查各组关节及滑膜病理学变化;ELISA法检测各组血清中b FGF、IL-6、IL-10含量;免疫组化检测各组滑膜组织中PHDs/p VHL/HIF-α途径相关蛋白的表达。2)体外实验:成功建立体外缺氧模型后,分别以GE（5μM、10μM、20μM）、HIF-α抑制剂2ME2（5μM）体外干预,并引入PHD2抑制剂IOX4（100 n M）、蛋白酶抑制剂MG132（100 n M）分别单独或联合GE给药,进一步探究GE具体作用机制。CCK-8法检测各组MH7A增殖活性,ELISA法检测各组培养基上清中b FGF、IL-6、IL-10含量;Western-blot检测PHDs/p VHL/HIF-α途径相关蛋白的表达;荧光激活细胞分选术（FACS）检测细胞周期,Ed U荧光染色测定细胞增殖。3结果3.1 GE对AA大鼠PHDs/p VHL/HIF-α途径的影响及治疗作用3.1.1 GE对AA大鼠关节炎症的影响与正常组大鼠比较,AA模型组大鼠表现出明显的关节炎症状,足肿胀度、关节炎指数及全身表现评分均明显升高,病理显示踝关节软骨及滑膜组织异常增生;GE灌胃给药后,足肿胀度、关节炎指数及全身表现评分均有不同程度的下降,关节软骨及滑膜组织异常增生明显被抑制,炎性细胞浸润减轻,缓解关节炎症。3.1.2 GE对AA大鼠血清中增殖相关因子的影响与正常组大鼠比较,AA模型组大鼠血清中增殖相关因子b FGF、IL-6分泌水平明显上升,IL-10分泌水平明显下降。GE能明显下调血清中b FGF、IL-6分泌,上调IL-10分泌。3.1.3 GE对AA大鼠关节滑膜PHDs/p VHL/HIF-α相关蛋白表达的影响与正常组大鼠比较,AA模型组大鼠PHDs/p VHL/HIF-α途径中关键酶PHD2及HIF-1α、HIF-2α表达水平显著升高。GE治疗后,PHD2及HIF-1α、HIF-2α表达水平出现不同程度下降,均与关节炎症表现相一致。提示GE可能通过干预PHDs/p VHL/HIF-α途径,抑制滑膜组织异常增生,缓解关节炎症症状,发挥治疗RA的作用。3.2 GE干预PHDs/p VHL/HIF-α信号转导对缺氧诱导MH7A增殖作用的影响3.2.1 GE体外给药对缺氧诱导MH7A增殖活性的影响与常氧正常组比较,缺氧模型组MH7A增殖活性明显升高;GE体外干预后,缺氧诱导MH7A增殖活性明显降低。3.2.2 GE体外给药对缺氧诱导MH7A中增殖相关因子分泌水平的影响与常氧正常组比较,缺氧模型组增殖相关因子b FGF、IL-6分泌水平明显上升,IL-10分泌水平明显下降;GE体外干预后,缺氧诱导MH7A增殖相关因子b FGF、IL-6分泌水平明显下降,IL-10分泌水平明显升高,提示GE可恢复增殖相关因子动态平衡。3.2.3 GE体外给药对缺氧诱导MH7A中PHDs/p VHL/HIF-α信号通路关键分子表达的影响与常氧正常组比较,缺氧模型组MH7A中PHD2、HIF-1α表达明显升高,增殖相关蛋白cyclin D1、PCNA、BNIP3表达显著升高;GE体外干预后,缺氧诱导MH7A中PHD2水平持续升高,HIF-1α、cyclin D1、PCNA、BNIP3表达显著下降。提示GE可能通过上调PHD2水平,干预PHD2/p VHL/HIF-1α信号转导,抑制下游信号通路的激活,进而抑制细胞增殖。3.2.4 GE对缺氧诱导MH7A中细胞增殖的影响FACS与Ed U增殖测定结果表明,与常氧正常组比较,缺氧模型组MH7A中S期细胞和Ed U荧光表达百分比明显增高,细胞增殖异常。GE体外干预后,缺氧诱导MH7A中S期细胞和Ed U荧光表达百分比明显降低,异常增殖作用被抑制,与增殖活性结果一致。3.3 GE干预缺氧诱导MH7A增殖功能改变的机制研究3.3.1 GE对抑制剂干预的MH7A增殖活性的影响与缺氧模型组比较,蛋白酶体抑制剂MG132组、PHD2抑制剂IOX4组均增强MH7A增殖活性;与单抑制剂比较,GE与各抑制剂分别联合干预后,MH7A增殖活性明显降低。3.3.2 GE对抑制剂干预的MH7A中HIF-1α信号通路关键分子表达的影响与缺氧模型组比较,单抑制剂MG132组PHD2水平显著升高,IOX4组PHD2水平显著下降,HIF-1α、cyclin D1、PCNA、BNIP3表达均明显增多;与单抑制剂比较,GE与各抑制剂分别联合干预后,PHD2水平明显持续升高,HIF-1α、cyclin D1、PCNA、BNIP3表达明显下降。3.3.3 GE对抑制剂干预的MH7A细胞增殖的影响与缺氧模型组比较,单抑制剂MG132、IOX4组S期细胞和Ed U荧光表达百分比明显增大;与单抑制剂比较,GE与各抑制剂分别联合干预后,S期细胞和Ed U荧光表达百分比明显减小,与增殖活性结果一致。4结论1)GE可抑制滑膜组织异常增生,缓解AA大鼠关节炎症,其作用机制可能是通过干预PHDs/pVHL/HIF-α途径信号转导实现。2)GE通过上调PHD2水平,加速HIF-1α羟基化降解,干预PHD2/p VHL/HIF-1α信号转导,进而抑制细胞增殖。3)GE可逆转IOX4和MG132对缺氧诱导MH7A增殖的促进作用,表明除促进HIF-1α羟基化降解外,GE还可能经PHD2依赖的非羟基化途径调控HIF-1α表达,阻滞HIF-1α下游信号通路激活,进而抑制细胞增殖,改善关节滑膜缺氧,发挥治疗RA作用。