背景和研究目标:消除疟疾的核心策略之一是通过发现和管理所有疟原虫感染者,以达到清点拔源、阻断传播的目的。疟疾无症状感染者被认为是“传染源储存库”,在疟疾传播和传染源管理中具有重要意义。中缅边境作为我国消除疟疾的重点难点地区,边境两侧疟疾发病和无症状感染水平在消除疟疾过程中逐渐引起关注,但对无症状感染者流行病学特征、带虫持续时间以及分子机制缺少系统研究。本课题围绕中缅边境疟疾无症状感染水平、流行病学特征和影响因素开展研究,为该地区实施消除疟疾“线索追踪、清点拔源”核心策略和巩固消除疟疾成果提供科学依据。技术路线:本文分三部分开展研究,首先比较镜检、荧光PCR和超敏PCR等当前用于疟原虫检测的常用方法对无症状感染者的检测敏感性和一致性,从中优选出对无症状感染者最敏感的检测方法,在中缅边境两侧选点开展横断面研究,了解边境两侧疟疾无症状感染水平（第一部分）;现场收集调查对象的基本信息和职业、人蚊接触和疟疾罹患史等与疟原虫感染有关信息,进行单因素与多因素分析,并对个体免疫相关基因位点和疟原虫抗性分子多态性进行检测,以阐明无症状感染者的流行病学特征及其影响因素（第二部分）;同时对调查发现的疟疾无症状感染者进行队列研究,探讨无症状感染持续时间、感染状态动态变化特征及其可能的影响因素（第三部分）。方法:利用中缅边境地区既往现场采集的居民血样,比较显微镜检测、超敏PCR法与荧光PCR法对无症状感染的检出率和一致性,遴选无症状感染者筛查最敏感的方法,在云南中缅边境两侧的4个村寨/安置点开展疟疾无症状感染水平横断面研究。收集调查对象的年龄、性别、职业、外出特征、蚊媒暴露、近期疟疾罹患史等资料,应用单因素和多因素分析方法,阐明无症状感染者的人群流行病学特征及其主要影响因素。在分子水平对调查发现的无症状感染者抗性分子标记多态性进行分析,运用飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分型技术对免疫相关分子 TLR SNP 位点（TLR9 T1486C、TLR9 G1174A、TLR5 R392Stop）进行检测,分析TLR SNP位点的等位基因和基因型多态性对无症状感染的影响。同时对无症状感染者进行队列研究,运用Kaplan-Meier法和Cox比例风险回归模型分析无症状带虫持续时间、感染状态变化特征及其影响因素。结果:超敏PCR法对无症状感染者的检出率最高,387份样本中检出38例阳性,检出率达9.82%;荧光PCR法检出阳性13例,检出率3.36%;镜检仅检出6例,检出率仅为1.55%。超敏PCR法与另两种方法的一致性较好,与荧光PCR法和显微镜检测的观察一致性分别为93.54%和91.73%,且荧光PCR法和显微镜检测发现的阳性者,超敏PCR法均能检出,表明超敏PCR法对无症状感染者的检出最为敏感。采用超敏PCR法在中缅边境两侧4个村寨/安置点（境外3个,境内1个）对共1147个居民开展无症状感染水平的横断面研究,结果发现该地区无症状感染率为8.81%,均为间日疟。境外调查点的无症状感染率（9.60%）显著高于境内（3.40%）（χ2=6.13,P=0.01）。检测分析不同疟疾发病率年份的人群血样,发现境内无症状感染水平因发病率不同有显著差异,2014年境内调查点疟疾发病率为0.40%,其无症状感染率为9.75%,而2019年同一调查点疟疾发病率为0%,无症状感染率为3.40%（χ2=5.54,P=0.02）。境外不同采样年份虽然疟疾发病率有下降,但无症状感染水平无明显变化,分别为10.00%和9.60%。流行病学特征分析发现,男性无症状感染率（10.91%）明显高于女性（7.21%）（χ2=4.78,P=0.03）,不同年龄无症状感染水平亦有显著差异（χ2=14.89,P=0.02）,51～60岁组最高为17.57%。男性41～50岁年龄组无症状感染率最高,为22.58%;而女性51-60岁最高,为15.69%,另女性11～20岁年龄组亦较高,达8.77%。单因素和多因素分析表明,性别、主要生活/工作场所、每周最远外出距离为无症状感染的影响因素,即男性（OR=1.73,95%CI=1.05～2.85）、生活/工作场所主要为室外（OR=1.96,95%CI=1.05～3.65）、每周外出距离较远（与≤1公里相比,每周最远距离1～5公里:OR=2.76,95%CI=1.55～4.92;每周最远距离＞5公里:OR=2.88,95%CI=1.21～6.87）是无症状感染的主要危险因素。TLR SNP位点等位基因多态性分析发现,与AA基因型相比,TLR9 T1486C位点AG基因型是无症状感染的保护因素（校正OR=0.45,95%CI-0.24～0.84）。抗性分子标记多态性分析显示,间日疟无症状感染者抗性分子标记多态性明显,包括:Pvdhfr突变型占100%、Pvdhps突变型占40%、Pvmdr1突变型占100%、Pvcrt-o突变型占40%;恶性疟无症状感染者Pfcrt亦为突变型。间日疟无症状感染者抗性分子标记多态性分布与确诊病例无明显差别。队列研究表明,中缅边境地区间日疟无症状感染者发展至有症状的比例为3.85%（3/78）。Kaplan-Meier法分析显示,无症状感染持续时间平均（中位数）为8周,感染状态变化模式多样,24.36%的随访者表现为持续阳性、20.51%持续1～4次阳性后转阴、32.05%表现为间断性阳性、11.54%呈现一过性阳性。Cox比例风险回归模型分析表明,年龄、外出频率、森林/林区暴露史是影响无症状感染持续时间的重要因素,其中相较于≤20岁组,年龄＞20岁无症状感染者从阳性转阴的概率更高,风险比HR为2.11（95%CI=1.12～3.97）;与不外出者相比,经常外出者从无症状感染阳性转阴的概率较低,风险比HR为0.39（95%CI=0.16～0.96）;与无森林/林区暴露者相比,有暴露史者从无症状感染阳性转阴的概率较低,风险比HR为0.51（95%CI=0.27～0.94）。结论:中缅边境地区疟疾无症状感染水平较高,发病较高的缅甸一侧其无症状感染水平显著高于发病较低的云南一侧。流行病学特征表现为男性和51～60岁是高发人群,男、女性无症状感染的年龄分布不同。性别、主要生活/工作场所、每周较远距离外出是无症状感染率的主要影响因素,上述流行病学特征显示无症状感染和疟疾显性发病一样与人蚊接触关系紧密。队列研究发现,近四分之一无症状感染者持续带虫,持续时间平均（中位数）达8周,年龄、外出频率和森林/林区暴露史是无症状感染持续时间的主要影响因素。

目的比较HemoCue@hb301仪(以下简称HemoCue仪)和Sysmex全自动血液分析仪测定血红蛋白水平的相关性和一致性,评估HemoCue仪检测血红蛋白(hemoglobin,Hb)应用于现场人群调查的适用性。方法用HemoCue仪和Sysmex全自动血液分析仪对相同的100例人体全血标本进行检测,比较两者测定的Hb值的相关性和一致性。采用随机数字法选取45份标本并分成3组,每份标本再平均分成4份,分别在常温,-4℃与-20℃条件下储存不同时间(12,24,36和48h)后用HemoCue仪测定Hb含量,比较不同储存温度和时间对检测结果的影响。结果两种方法的检测结果具有较好的相关性,r=0.995,但HemoCue仪测定值较Sysmex高,两者差异有统计学意义(t=11.471,P <0.001)。两种方法的一致性较好,LoA为(1.8,14.4)。HemoCue仪诊断贫血的灵敏度为58.62%,特异度为100%,阳性预测值为100%,阴性预测值为85.54%。三次重复测量的组间相关系数ICC为0.996,95%CI 0.993～0.997。常温下与-20℃下分别储存0～48 h后,Hb值略有升高趋势。4℃组储存条件下Hb含量相对稳定。结论 HemoCue仪在检测Hb含量有较好的一致性和稳定性,适合于现场应用。

目的比较间日疟原虫感染人群的Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)5、TLR9基因3个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点差异,探讨其与间日疟原虫不同感染类型的相关性。方法收集中缅边境地区(云南省盈江县和缅甸拉咱市)2017—2019年间日疟原虫感染者202例及健康对照者104例,将上述研究对象分为无症状感染组、有症状感染组及健康对照组,其中无症状感染组与有症状感染组统称为感染组;采用飞行时间质谱分型技术检测以上研究对象TLR5、TLR9基因3个SNP位点,分析不同组之间TLR5、TLR9基因SNP位点等位基因和基因型的分布差异。结果 3组研究对象之间性别与年龄分布差异均无统计学意义(P均> 0.05);3组之间TLR9 1486C/T位点、TLR9 G1174A位点和TLR5 R392Stop位点的等位基因分布差异均无统计学意义(P均> 0.05);健康对照组与感染组间及健康对照组与无症状感染组间TLR9 1486C/T位点的AG基因型分布差异均有显著性统计学意义(P均 0.05)。结论 TLR9 1486C/T位点的基因型多态性与间日疟原虫感染相关,但尚未发现TLR9 G1174A位点、TLR5 R392Stop位点与间日疟原虫感染的相关性,本研究结果可为揭示宿主基因多态性对间日疟原虫感染的影响提供重要线索。

Background Understanding the genetic structure of natural populations provides insight into the demographic and adaptive processes that have affected those populations. Such information, particularly when integrated with geospatial data, can have translational applications for a variety of fields, including public health. Estimated effective migration surfaces (EEMS) is an approach that allows visualization of the spatial patterns in genomic data to understand population structure and migration. In this study, we developed a workflow to optimize the resolution of spatial grids used to generate EEMS migration maps and applied this optimized workflow to estimate migration of Plasmodium falciparum in Cambodia and bordering regions of Thailand and Vietnam. Methods The optimal density of EEMS grids was determined based on a new workflow created using density clustering to define genomic clusters and the spatial distance between genomic clusters. Topological skeletons were used to capture the spatial distribution for each genomic cluster and to determine the EEMS grid density; i.e., both genomic and spatial clustering were used to guide the optimization of EEMS grids. Model accuracy for migration estimates using the optimized workflow was tested and compared to grid resolutions selected without the optimized workflow. As a test case, the optimized workflow was applied to genomic data generated from P. falciparum sampled in Cambodia and bordering regions, and migration maps were compared to estimates of malaria endemicity, as well as geographic properties of the study area, as a means of validating observed migration patterns. Results Optimized grids displayed both high model accuracy and reduced computing time compared to grid densities selected in an unguided manner. In addition, EEMS migration maps generated for P. falciparum using the optimized grid corresponded to estimates of malaria endemicity and geographic properties of the study region that might be expected to impact malaria parasite migration, supporting the validity of the observed migration patterns. Conclusions Optimized grids reduce spatial uncertainty in the EEMS contours that can result from user-defined parameters, such as the resolution of the spatial grid used in the model. This workflow will be useful to a broad range of EEMS users as it can be applied to analyses involving other organisms of interest and geographic areas.

Vaccines based on Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1 (AMA1) have failed due to extensive polymorphism in AMA1. To assess the strain-specificity of antibody responses to malaria infection and AMA1 vaccination, we designed protein and peptide microarrays representing hundreds of unique AMA1 variants. Following clinical malaria episodes, children had short-lived, sequence-independent increases in average whole-protein seroreactivity, as well as strain-specific responses to peptides representing diverse epitopes. Vaccination resulted in dramatically increased seroreactivity to all 263 AMA1 whole-protein variants. High-density peptide analysis revealed that vaccinated children had increases in seroreactivity to four distinct epitopes that exceeded responses to natural infection. A single amino acid change was critical to seroreactivity to peptides in a region of AMA1 associated with strain-specific vaccine efficacy. Antibody measurements using whole antigens may be biased towards conserved, immunodominant epitopes. Peptide microarrays may help to identify immunogenic epitopes, define correlates of vaccine protection, and measure strain-specific vaccine-induced antibodies.

摘要： 目的 比较3种不同检测方法对疟疾无症状感染者的检出能力,并了解中缅边境地区的疟疾无症状感染水平。方法 2014年7月在中缅边境地区云南省盈江县选择那邦镇、支那乡和缅甸拉咱安置点等3个调查点,采集调查对象血样,制作厚薄血膜和滤纸血标本,分别采用显微镜观察、荧光定量PCR和超敏PCR检测其疟原虫感染情况。结果 共采集387例血样,显微镜观察检出6例无症状感染者(间日疟5例、恶性疟1例),感染检出率为1.6%;荧光定量PCR检出13例无症状感染者(间日疟12例、恶性疟1例),感染检出率为3.4%;超敏PCR检出38例无症状感染者(间日疟29例、恶性疟9例),感染检出率为9.8%。以显微镜观察为疟原虫感染诊断的金标准,荧光定量PCR检测无症状感染者的灵敏度为100%,特异性为98.2%;超敏PCR检测无症状感染者的灵敏度为100%,特异性91.6%。超敏PCR结果显示,那邦镇的无症状感染检出率最高,为17.1%(22/129),其次为缅甸拉咱难民安置点,为10.0%(11/110),支那乡最低,为3.4%(5/148),3个调查点的感染检出率差异统计学意义(P0.05)。不同年龄组以15～29岁的无症状感染检出率最高,为17.5%(10/57),各年龄组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用超敏PCR对疟疾无症状感染者的检出率高于荧光定量PCR和显微镜观察。中缅边境地区人群中存在一定比例的疟疾无症状感染者。

摘要： 疟疾无症状感染者在疟疾传播中具有重要作用,掌握其流行病学特征对实现消除疟疾目标具有重要的公共卫生意义。现有研究认为,无症状感染者分布广泛,在不同季节、不同传播水平地区以及任何年龄段均可发生,且受宿主、疟原虫、环境和传播媒介等多个方面的影响。本文综述了疟疾无症状感染者的定义、流行病学特征及其影响因素,为消除疟疾提供参考资料。