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DNA-PKcs通过SCF泛素连接酶调控EXO1蛋白稳定性及其DNA同源重组修复中的末端剪切功能机制研究

项目来源

国家自然科学基金(NSFC)

项目主持人

周平坤

项目受资助机构

中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

立项年度

2018

立项时间

未公开

项目编号

31870847

项目级别

国家级

研究期限

未知 / 未知

受资助金额

59.00万元

学科

生命科学-生物物理与生物化学-细胞感应与环境生物物理

学科代码

C-C05-C0503

基金类别

面上项目

关键词

电离辐射损伤 ; 损伤修复 ; 信号转导 ; 信号分子 ; 电离辐射修复

参与者

谢达菲；杨陟华；王豫；高山山；郭宗培；李雪萍；刘政；王铎

参与机构

未公开

项目标书摘要：DNA双链断裂(DSB)是放射诱发的严重损伤，真核生物有同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)两条主要修复通路。DSB经末端剪切形成一段单链DNA,是启动HR修复的关键，也是修复通路选择的调控点。前期发现,DNA-PKcs失活将导致执行DSB末端剪切的核酸酶EXO1的表达和稳定性显著改变。本课题将深入开展DNA-PKcs调控EXO1泛素化降解的上游信号通路和下游修复功能的研究：明确DNA-PKcs对放射损伤及细胞周期(G1 vs G2)EXO1表达和修饰(泛素化、磷酸化等)的影响规律；探讨SCF E3泛素连接酶对EXO1泛素化的调控机制，重点是DNA-PKcs直接或通过与RBX1的相互作用，对SCF催化核心Cullin-1蛋白的类泛素化修饰及作用于EXO1的活性调控机制；通过观测DSB末端剪切，明确DNA-PKcs通过上述作用对EXO1功能的调控机制，加深对放射生物学机制理论认识。

Application Abstract: DNA double-strand break(DSB)is a severe damage induced by ionizing radiation.There are two major pathways of DSB repairing in eukaryotic cells:homologous recombination(HR)and non-homologous end joining(NHEJ).The yield 3’ssDNA of DSB through the end resection is a key reaction for initiating HR pathway,also a key regulation point for the DSB repair pathway choice.In our previous study,we found the inaction of DNA-PKcs led to a significant decrease of expression and protein stability of the exonuclease EXO1,the critical molecule of executing DSB end resection of HR pathway.Here,this project will further study the upstream signaling pathway and downstream repair function of EXO1 ubiquitination regulated by DNA-PKcs,including:The effects of DNA-PKcs on the alterations of EXO1 ubiquitination and phosphorylation,and the stability after irradiation and in different cell cycle phases;the regulation mechanism of EXO1 ubiquitination by SCF E3 ubiquitin ligase,especially focus on by the direct action and through interaction with RBX1,DNA-PKcs regulates the neddylation of Cullin-1,a component of SCF E3 ubiquitination ligase catalytic core,and its ubiquitin ligase activity on EXO1.Through the observation of DSB end resection reaction,to further elucidate the regulation mechanism of DNA-PKcs on EXO1 repair function.This project will provide further mechanism theory to advance our knowledge on radiation biology.

项目受资助省

北京市

项目结题报告(全文)

DNA双链断裂(DSB)是电离辐射(IR)诱导的最为严重的DNA损伤形式之一，深入研究其精确修复机制，对发展新型放射损伤防护药物、维持基因组的稳定性具有重要意义。DSB的修复通路，主要包括同源重组(HR)修复和非同源末端链接(NHEJ)修复，其中HR修复通路需要同源DNA作为修复模板，仅发生在S/G2期，而G1期细胞只能选择NHEJ修复通路，因此，两者在不同细胞周期的选择和转换对DSB精确修复非常重要。在G1期细胞中，由于缺乏基因组范围内同源DNA(姐妹染色单体DNA尚未合成),因此无法试行和完成HR修复,G1期细胞是如何限制HR修复，确保G1期NHEJ修复顺利进行的机制尚不完全清楚。在DNA双链断裂(DSBs)同源重组修复通路起始阶段，需要进行DSB末端单链切割形成HR修复所必须的末端单链DNA(ssDNA),本研究围绕此过程的关键执行者EXO1的功能调节，以及DNA-PKcs在其中的调控作用展开研究，取得了具有重要理论意义和实践价值的科学发现，主要包括：(1)发现EXO1蛋白在G1期细胞中发生泛素化修饰，由此介导其降解，而在G2期细胞中EXO1蛋白表达较高，以便其执行功能；(2)揭示了RBX1蛋白促进SCF E3泛素连接酶关键组分Cullin 1的类泛素化修饰，促使其介导EXO1蛋白降解；(3)揭示RBX1蛋白促进G1期细胞EXO1泛素化降解对电离辐射损伤具有保护作用；(4)揭示DNA-PKcs激酶在G1细胞的自磷酸化和激酶活性显著高于G2期细胞，由此导致G1期细胞RBX1的高表达。上述科学发现，阐述了一种促进细胞DNA双链断裂修复通路的精确选择的新机制——DNA-PKcs在G1细胞中上调RBX1表达、介导EXO1蛋白泛素化降解，从而限制G1期细胞对DSBs的末端DNA单链切割，避免选择无法完成的HR修复通路，以便于执行非同源末端连接修复通路。本研究的科学发现为深入阐述放射致DNA双链断裂的修复机制提供了科学证据，为发展更有效的放射损伤防护技术奠定理论和实验基础。

  • 排序方式：
  • 1
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  • 1.ZGRF1调控DNA双链断裂同源重组修复和G2/M周期阻滞的机制研究

    • 关键词：
    • 放射损伤;ZGRF1;DNA双链断裂;同源重组修复;末端单链剪切;G2/M检查点
    • 颜爽
    • 指导老师：南华大学 周平坤
    • 学位论文

    DNA双链断裂（DSBs）是电离辐射诱发最严重的DNA损伤类型,在哺乳动物细胞中DSBs主要由非同源末端连接（NHEJ）与同源重组（HR）两个途径进行修复。核酸外切酶EXO1介导的DSBs末端单链剪切在HR修复以及ATR-CHK1途径诱导的G2/M周期阻滞中发挥着重要调控作用,但其具体机制还不清楚。ZGRF1被鉴定为参与DNA损伤修复的重要解旋酶,但对其具体的作用机制鲜有研究,ZGRF1参与损伤修复的分子过程有待揭示。目的:研究ZGRF1在电离辐射诱发DNA损伤修复中的作用,探索ZGRF1参与的DNA修复通路及调控点、与已知的关键DNA修复蛋白的相互作用和相互调节的关系,阐述其主要的生物学意义。方法:（1）通过质谱分析鉴定辐照后ZGRF1形成的复合体中的蛋白质组分,采用免疫共沉淀（Co-IP）验证辐照前后ZGRF1与复合体成分中BRCA1、EXO1等的相互作用;（2）免疫荧光共定位（IF）检验在电离辐射损伤的HeLa细胞中ZGRF1与DSBs分子标志物γH2AX的共定位情况,ZGRF1与BRCA1、53BP1、MDC1、RNF8、EXO1等修复蛋白在DNA双链断裂位点的共定位;（3）检测ZGRF1敲除的HeLa细胞中DNA断裂末端单链DNA（3’ss DNA）生成标志物——RPA2在双链断裂位点的焦点（foci）形成;（4）使用DR-GFP和EJ-GFP报告系统分析野生型和ZGRF1敲除的HeLa细胞的HR和NHEJ修复效率,确定ZGRF1参与的DNA修复途径;分别单独敲低BRCA1、EXO1、BLM或与ZGRF1双敲低,检测ZGRF1与上述分子在HR修复通路中的相互调节关系;（5）克隆形成实验检测野生型和ZGRF1敲除的HeLa细胞和MDA-MB-231细胞对辐照以及PARP抑制剂（PARPi）Olarparib的敏感性,选用SR50指标进一步评价细胞对PARPi的敏感性;（6）MTT实验分析ZGRF1敲除的HeLa细胞和MDA-MB-231细胞对其他DNA损伤诱导剂（ADR、Cisplatin、ETO、CPT、MMC）的敏感性;（7）免疫印迹检测辐照后RPA2、细胞周期调控蛋白CHK1、CHK2等蛋白表达水平及磷酸化水平;（8）流式细胞仪检测野生型与ZGRF1敲除细胞辐照后的周期分布和凋亡发生率,并对G2/M期细胞进行定量统计分析。用磷酸化组蛋白H3p Ser10抗体免疫染色标记有丝分裂期细胞,流式细胞仪检测辐照后野生型与ZGRF1敲除细胞中阳性细胞,并进行统计分析;用诺考达唑处理细胞,使细胞停滞在有丝分裂期,流式细胞仪检测辐照后野生型与ZGRF1敲除细胞中有丝分裂期细胞比例。结果:（1）通过质谱分析和免疫共沉淀分析,发现ZGRF1与DNA修复相关蛋白BRCA1和EXO1存在相互作用,并且在电离辐射诱导DNA损伤后相互作用增强;（2）电离辐射后,ZGRF1与γH2AX形成共定位聚焦点,在受照射2小时之后ZGRF1敲除细胞中残留的γH2AX焦点数量显著高于野生型细胞,表明ZGRF1敲除细胞的DNA双链断裂修复效率降低。进一步分析显示,敲除ZGRF1导致DNA同源重组修复效率降低40%。在ZGRF1敲除细胞中再分别敲低BRCA1、EXO1,细胞的同源重组修复效率与单独敲低BRCA1、EXO1无明显差异,但略比单敲ZGRF1的修复效率低,同时敲低ZGRF1和BLM后细胞的同源重组修复效率降低更加显著,且低于二者任一单独敲低细胞的修复效率,提示ZGRF1与BLM在HR修复通路中的解旋酶作用有一定的互补性;（3）ZGRF1向DSB位点的募集受到BRCA1、MDC1和RNF8的影响,并不受53BP1的影响。敲除ZGRF1,RPA2焦点的形成显著减少,表明ZGRF1参与对DSBs断裂末端的单链DNA剪切形成3’ss DNA的调控;（4）敲除ZGRF1,抑制了IR诱导的RPA2和CHK1的磷酸化,但对RPA2和CHK1的蛋白总水平没有影响;（5）野生型与ZGRF1敲除的HeLa细胞的G2和M期细胞所占的百分比在照射后早期无明显差异。在照射后4-8小时,G2和M期细胞明显上升,但ZGRF1敲除细胞组的G2和M期细胞的百分比显著低于野生型细胞,而在照射后12小时,ZGRF1敲除细胞的G2和M期细胞百分比恢复至野生型水平。进一步分析M期细胞比例的变化发现,野生型在照射后1小时有丝分裂期细胞数量即明显减少,ZGRF1敲除细胞在照射后2小时后才开始明显减少,照后4小时则与野生型组数量无差异,恢复至野生型水平,表明敲除ZGRF1导致受照射细胞周期G2/M阻滞延迟;（6）ZGRF1敲除后的HeLa细胞和MDA-MB-231细胞在电离辐射后凋亡率增加,对电离辐射、PARP抑制剂Olaparib等DNA损伤化疗药物的敏感性显著增加。结论:ZGRF1参与调节电离辐射诱发DNA双链断裂的同源重组修复通路活性,揭示其通过协同EXO1的作用,介导DNA双链断裂末端单链剪切形成3’ss DNA,从而促进HR修复和G2/M周期阻滞的新机制。ZGRF1依赖于BRCA1与MDC1-RNF1通路募集到DNA损伤位点,在HR修复通路上可能与BLM的解旋酶活性存在功能互补。此外,ZGRF1敲除增加宫颈癌和乳腺癌细胞系对PARPi、IR等多种DNA损伤剂处理的敏感性。该研究为电离辐射所致DNA损伤修复调控和细胞放射敏感性提供了新的机制阐述,也为临床肿瘤的治疗提供了新的潜在靶点。

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