项目来源

国家自然科学基金(NSFC)

项目主持人

司美茹

项目受资助机构

曲阜师范大学

项目编号

31970034

立项年度

2019

立项时间

未公开

项目级别

国家级

研究期限

未知 / 未知

受资助金额

58.00万元

学科

生命科学-微生物学-微生物生理与生化

学科代码

C-C01-C0102

基金类别

面上项目

关键词

氧化胁迫 ; 谷氨酸棒杆菌 ; 响应机理 ; 微生物的环境适应性及机制 ; 调控蛋白 ;

参与者

苏涛；宋文霞；李桂芝；李晓娜；谷松鹤；刘逸霏；姜洁

参与机构

未公开

项目标书摘要：调控元件的硫醇开关转换修饰是一种最重要、最有效的细菌应答氧化应激的翻译后修饰调控装置，主要包括次磺酸化、S-硫醇化、蛋白二硫化、S-磷酸化、S-硝基化和S-烷基化7种状态。但目前在分枝硫醇(MSH)为胞内主要硫醇的重要工业和模式生物—谷氨酸棒杆菌中仅报道了几个以蛋白二硫化修饰为基础的调控蛋白，对核心硫醇调控开关—分枝硫醇化修饰的调控蛋白所知极为有限。本项目联合运用蛋白组学、转录组学及生物素—链亲和色谱技术，系统筛选鉴定不同种类、不同水平氧化应激下的硫醇开关调控蛋白。同时采用存活率、核磁共振、圆二色谱、X射线、胞内氧化还原电位、免疫共沉淀、RT-PCR、EMSA等技术方法研究调控蛋白响应氧化应激的生理生化功能、分子机理及差异与串联动态分子机制。研究结果不仅有助于完善以硫醇开关转换修饰为基础的调控蛋白的网络，并能为以MSH为主要硫醇的重要病原和工业微生物抗氧胁迫机制领域研究带来重要突破。

Application Abstract: Thiol-based redox switch in regulators is the most important and effective post-translational modification regulatory device for bacterial response to oxidative stress.Thiol-based redox switch mechanism mainly includes seven states of sulfenylation,S-thiol,protein disulfide,S-phosphorylation,S-nitrification and S-alkylation.However,only a few disulfide-based regulators have been reported in the mycothiol(MSH)-producing industrial model strain Corynebacterium glutamicum,and little is known about the regulatory proteins of the core thiol switch-mycothiolated modification.In this study,by using C.glutamicum as the research material,we will systematically screen and identify redox-sensitive regulatory under different concentrations of various oxidative stresses based on combining proteomics,transcriptomics and biotin-streptomycin affinity chromatography.On this basis,the physiological and biochemical function,molecular mechanism,and differential-tandem dynamic mechanisms of regulatory are studied by using viability,nuclear magnetic resonance,circular dichroism,X-ray,intracellular redox potential,co-immunoprecipitation,RT-PCR,and EMSA.Through the implementation of this project,it not only can improve the thiol switch-based network of redox-sensitive regulatory proteins,but also lead to significant breakthroughs for the study of oxidative stress resistance in medical bacteria and important industrial containing MSH.

项目受资助省

山东省

项目结题报告(全文)

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是生物有氧代谢过程中或面临不利条件时产生的副产物。过多ROS会诱发细胞氧胁迫，从而破坏生物大分子，造成细胞功能紊乱，导致各种疾病、衰老乃至死亡。生物响应氧化应激最重要、最普遍的调控装置是硫醇—二硫键开关转换修饰模型(包括S-谷胱甘肽化和蛋白二硫化)。然而，以分枝硫醇(MSH)为胞内主要硫醇、具有重要经济和病原菌的典型模式生物的谷氨酸棒杆菌中是否装备着硫醇开关转换修饰的调控元件尚不清楚，对于核心硫醇调控开关—分枝硫醇化修饰是否存在于调控元件中更是函待解决的重要科学问题。在本项目资助下，申请人按计划从全局角度筛选鉴定谷氨酸棒杆菌在不同浓度不同种类活性化合物胁迫下硫醇开关转换修饰的调控蛋白，揭示其响应信号刺激的差异和串联动态机制的分子机理这一重要科学问题为目标，开展了多个方面的工作。这些研究包括：首先，利用蛋白质组学、转录组学、生物素—链亲和色谱与Mrx1:C15S/Trx还原系统偶联技术及MALDI-TOF-TOF质谱技术，筛选鉴定了10个在不同种类不同浓度活性氧化合物胁迫下发生硫醇修饰的新调控蛋白；紧接着，利用基因敲除、互补、qRT-PCR、Western-blotting、β-gal酶活等方法对其中5个调控蛋白进行了研究，发现它们具有抗胁迫并受胁迫物诱导表达，进一步证实了它们以分子间、分子内二硫键及分枝硫醇化修饰的方式响应氧化压力；其次，阐述了梯度和差异氧化应激的分子机制，发现在 H2O2 胁迫下具有不同硫醇修饰状态的 OxyR 比 SigH 具有更快速响应 H2O2 的能力以及OcsR专一响应高浓度OH.;最后，利用RNA-Seq 的转录组技术对2个调控蛋白突变后影响谷氨酸棒杆菌整体基因表达的情况进行了解析，进一步通过β-gal酶活测定、EMSA、qRT-PCR、DNase I footprinting等方法技术研究了它们对功能基因的调控方式和机制。部分相关研究工作发表在Biochemical Journal、Microbial Cell Factories等期刊上，其它研究也取得了阶段性进展并在准备投稿阶段。这些研究不仅对于深入了解谷氨酸棒杆菌、白喉棒杆菌、红球菌等放线菌目微生物抗氧化胁迫这一重要生命现象有重要的科学意义，而且能完善以硫醇开关转换为基础的氧化还原敏感调控蛋白的调控网络。