基于干细胞的神经组织模块构建及神经损伤修复研究
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1.SKP-SC-EVs对施万细胞的作用和机制研究
- 关键词:
- 皮肤前体细胞源施万细胞;胞外囊泡;神经损伤;施万细胞;miR-21-5p
- 武霞
- 指导老师:南通大学 丁斐
- 0年
- 学位论文
目的本实验旨在探究皮肤前体细胞源施万细胞(SKP-SCs)的胞外囊泡(SKP-SC-EVs)通过对施万细胞(SCs)功能的调控加强受损神经元修复的作用及机制,为阐明SKP-SC-EVs促进周围神经损伤后修复的作用提供理论和实验依据。方法1、培养SKP-SCs并分离获取SKP-SC-EVs,原代培养和纯化大鼠坐骨神经SCs,通过免疫染色观察SCs对SKP-SC-EVs的内化。2、CCK8活力检测和EdU染色观察SKP-SC-EVs促SCs增殖的作用。3、划痕实验检测SKP-SC-EVs促SCs迁移的作用。4、通过实时定量PCR,免疫细胞化学染色(ICC)和Western blot分别从基因和蛋白水平检测神经营养因子NGF、BDNF、Trk在SKP-SC-EVs处理后的SCs中的表达变化。5、通过Transwell共培养,观察SKP-SC-EVs预处理的SCs的迁移能力及促运动神经元的生长作用。6、通过体外建立神经元成髓鞘模型,观察SKP-SC-EVs对SCs成髓鞘的调控作用。7、建立坐骨神经损伤模型,体内观察SKP-SC-EVs促SCs增殖与迁移的作用。8、对SKP-SC-EVs进行miRNA测序分析,并验证高表达的miRNA。9、通过转染miR-21-5p mimic,分析miR-21-5p促SCs增殖与迁移的作用。10、通过生物信息学分析miR-21-5p靶基因,验证SKP-SC-EVs中的miR-21-5p对Eph A4的靶向作用。11、应用坐骨神经损伤模型,观察miR-21-5p促SCs增殖与迁移的作用。结果1、体外培养的SKPs悬浮成球生长,分化后的SKP-SCs呈双极的梭形,高表达S100β和GFAP。2、采用透射电镜观察分离的SKP-SC-EVs,其形态呈典型的杯托状,NTA粒径分析EVs平均粒径为137nm,且阳性表达HSP70、CD9、CD63、CD81和TSG101。3、ICC结果显示体外培养的SCs纯度良好,通过共聚焦显微镜成像发现SKP-SC-EVs可被SCs内化。4、CCK8检测和Ed U染色结果显示SKP-SC-EVs可以促进SCs的增殖。5、划痕实验结果显示SKP-SC-EVs可以促进SCs的迁移。6、通过实时定量PCR,ICC和Western blot分析发现SKP-SC-EVs可以促进SCs神经营养因子的表达。7、通过Transwell共培养,观察发现SKP-SC-EVs预处理的SCs迁移能力更强,并且可以促进运动神经元的轴突生长。8、SKP-SC-EVs可以促进体内SCs增殖与迁移。9、通过实时定量PCR发现SKP-SC-EVs中富含miR-21-5p.10、通过转染miR-21-5p mimic,发现miR-21-5p可以促进体外SCs的增殖和迁移。11、体内局部注射miR-21-5p可促进受损周围神经SCs的增殖和迁移。12、miR-21-5p可通过负调控EphA4影响SCs的生物学功能。结论1、SKP-SC-EVs可促进体内外SCs的增殖和迁移。2、SKP-SC-EVs可促进体外培养的SCs神经营养因子表达以及成髓鞘。3、SKP-SC-EVs通过促进SCs的生物学功能来进一步促进运动神经元的轴突生长。4、SKP-SC-EVs通过传递miR-21-5p靶向EphA4来促进SCs的增殖和迁移,并且体内局部注射miR-21-5p可促进受损周围神经SCs的增殖和迁移。
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