Entamoeba histolytica ; extracellular vesicles ; colon on chip
参与者AI
Peng;Ruofan;Santos;Herbert J;Nozaki;Tomoyoshi
参与机构
東京大学，大学院医学系研究科
项目标书摘要：E.histolytica における細胞外小胞(EV)生物学におけるCPBF1の機能的役割を明らかにするためには、標的遺伝子のサイレンシングが重要なステップとなります。CPBF1遺伝子の転写レベルでのサイレンシング株を再構築するためにこれまで複数回試みを行ってきましたが、いずれも安定なノックダウン株の樹立には至っていません。これらの試みは、CPBF1の安定的な発現抑制が技術的に困難であることを浮き彫りにしました。現在、この課題を克服し、今後の機能解析に繋げるために、RNA干渉(RNAi)法やCRISPRを用いたノックダウン法など、CPBF1の発現を抑制する代替的な戦略の検討を進めています。潰瘍性大腸炎、アメーバ性肝膿瘍(ALA)、および無症候性感染など、さまざまな臨床症状を呈する日本人患者由来の臨床分離株から得られたEntamoeba histolyticaの細胞外小胞(EV)のプロテオーム解析により、EVに関連する保存されたタンパク質群が明らかになった。特に、システインプロテアーゼ結合タンパク質ファミリー(CPBF)に属するCPBF1およびCPBF6の2つは、すべての分離株に共通して同定され、これらがE.histolyticaのコアEVプロテオームの構成要素である可能性が示唆された。対照的に、CPBF3、CPBF4、およびCPBF8は3つの分離株で検出され、CPBF7は1つの分離株のみに限定的に検出された。CPBFがシステインプロテアーゼ(CP)の受容体として機能することを踏まえ、CPに関するプロテオームプロファイルの解析も行った。その結果、CP-A1はすべての4分離株で普遍的に存在し、CP-8およびCP-A5は3つの分離株で検出された。これらの結果は、これまでのプロテオームデータと一致し、EVを介したCPの代替的分泌が特定のCPBFによって媒介されているという仮説を支持するものである。CPBF1を発現するE.histolytica由来のEVが宿主細胞に与える機能的影響を評価するため、CPBF1-HA発現株から単離したEVを、2Dおよび3Dのコロン・オン・チップ(COC)システムを用いて分化したヒト結腸上皮細胞と共培養した。4時間の共培養後、全RNAを抽出し、主要な炎症性およびバリア関連遺伝子の発現をPCRで評価した。その結果、CPBF1-HA EVsで処理した2Dおよび3D培養の両方で、モノサイト走化因子-1(MCP-1)の発現が有意に上昇していた。興味深いことに、ムチン2(MUC2)の発現は3D COCでのみ上昇していた。これらの知見は、特に生理学的により類似した3D結腸環境において、CPBF1を多く含むEVが免疫調節的役割を果たす可能性を示唆している。Entamoeba histolytica 由来の細胞外小胞(EV)が宿主の腸上皮細胞応答に与える影響について、より包括的かつ機構的に理解するため、本研究ではコロン・オン・チップ(COC)プラットフォーム上で分化誘導したヒト結腸上皮細胞を用いたトランスクリプトーム解析を行うことを計画しています。具体的には、CPBF1を過剰発現または遺伝子サイレンシングしたアメーバ株から単離したEV、ならびにそれぞれの対照株から得られたEVを用いて共培養を行い、RNAシークエンシング(RNA-seq)により全遺伝子発現変動を網羅的に解析します。このアプローチにより、CPBF1に依存した宿主応答と非依存的な応答の双方を同定することが可能となります。これらの条件間で得られるトランスクリプトームプロファイルを比較することで、上皮炎症、バリア機能制御、自然免疫応答などに関与する分子経路を明らかにすることを目的としています。さらに、CPBF1を含むEVおよび含まないEVを並列に用いた比較実験を通じて、EV内因子を介した寄生虫の病原性メカニズムと、それに応答する上皮細胞の転写応答の解明を試みます。本研究により、宿主―寄生体間の相互作用に関するシステムレベルでの理解が進むとともに、CPBF1がEVを介して宿主応答を制御する機能的役割の解明が期待されます。Reason:E.histolytica における細胞外小胞(EV)生物学におけるCPBF1の機能的役割を明らかにするためには、標的遺伝子のサイレンシングが重要なステップとなります。CPBF1遺伝子の転写レベルでのサイレンシング株を再構築するためにこれまで複数回試みを行ってきましたが、いずれも安定なノックダウン株の樹立には至っていません。これらの試みは、CPBF1の安定的な発現抑制が技術的に困難であることを浮き彫りにしました。現在、この課題を克服し、今後の機能解析に繋げるために、RNA干渉(RNAi)法やCRISPRを用いたノックダウン法など、CPBF1の発現を抑制する代替的な戦略の検討を進めています。Outline of Research at the Start:細胞外小胞(EV)は細菌から高等真核生物に至るまでユビキタスに細胞間情報伝達の一様式として保存されている。本申請研究においては、腸管寄生原虫赤痢アメーバのEVのプロテオーム情報から赤痢アメーバ特異的EVタンパク質の感染現象における役割を細胞生物学・遺伝学的手法・バイオエンジニアリングを駆使しながら解明することを目的とする。EVの精製、電顕による形態学的な確認、プロテオーム解析は既に終了している。本研究により赤痢アメーバのEVの構成要素の全容とEVの形成・放出・伝達の分子機構が解明され、ヒトと原虫自身に対するEVの病理・生理機能が解明される。
