第一章GSDMD介导的内皮细胞焦亡在脓毒症血管内皮损伤的作用及机制研究目的:探讨GSDMD介导的内皮细胞焦亡在脓毒症血管内皮损伤的作用及机制。方法:将LPS转染（tLPS）至脐静脉内皮细胞EA.hy926内诱导内皮细胞焦亡,或分别将对照及GSDMD干扰质粒转染至内皮细胞中,再诱导细胞焦亡,进而采用光镜观察焦亡细胞的形态改变,流式细胞术检测焦亡细胞的比例,乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒检测LDH释放,ELISA检测IL-1β水平,RTqPCR检测炎性Caspase和GSDMD mRNA表达,Western Blot或免疫荧光检测炎性Caspase和GSDMD蛋白表达和剪切。采用尾静脉注射含sh Gsdmd的腺相关病毒干扰小鼠体内Gsdmd表达,通过盲肠结扎穿孔术（CLP）构建脓毒症小鼠模型,采用透射电镜检测肺血管内皮细胞改变,称重检测小鼠肺湿重体重比,BCA法检测肺泡灌洗液中蛋白含量,Evans蓝实验检测肺血管通透性,ELISA检测血浆中IL-1β、IL-18和TNF-α分泌,HE染色检测多器官损伤情况。结果:tLPS刺激脐静脉内皮细胞,导致内皮细胞焦亡,LDH释放显著增加,IL-1β分泌明显增多,炎性Caspase和GSDMD mRNA和蛋白表达均明显增多,炎性Caspase和GSDMD剪切明显增多。转染GSDMD干扰质粒后,GSDMD mRNA和蛋白表达均显著降低,内皮细胞焦亡明显缓解,LDH释放显著减少,IL-1β分泌明显减少。脓毒症小鼠肺血管内皮细胞焦亡增多,肺湿重体重比升高,肺泡灌洗液中蛋白增多,肺组织中Evans蓝增多,血浆中炎症因子显著增多,肺脏、肾脏、肝脏和心脏器官损伤严重,而尾静脉注射含sh Gsdmd的腺相关病毒显著缓解肺血管内皮细胞焦亡,改善肺组织水肿,减少蛋白渗出,改善肺血管通透性,降低血浆中IL-1β和IL-18水平,缓解多个器官损伤。结论:GSDMD介导内皮细胞焦亡导致脓毒症血管内皮损伤、多器官功能障碍。第二章LncRNA NBR2通过GSDMD调控脓毒症血管内皮细胞焦亡的作用及机制研究目的:探讨lncRNA在脓毒症血管内皮细胞焦亡中的作用及机制。方法:采用基因芯片检测脓毒症患者血液中lncRNA和mRNA表达谱,加权基因共表达网络分析筛选与细胞焦亡相关的lncRNAs,tLPS刺激脐静脉内皮细胞EA.hy926诱导内皮细胞焦亡,RT-qPCR检测候选lncRNAs表达。通过小干扰RNA干扰候选lncRNAs表达筛选调控细胞焦亡的lncRNA。分别将lncRNA NBR2过表达质粒、GSDMD干扰质粒转染至内皮细胞中,并给予tLPS刺激,通过RT-qPCR检测候选lncRNAs、NBR2和GSDMD表达,Western Blot或免疫荧光检测炎性Caspase和GSDMD蛋白表达,观察内皮细胞焦亡的形态改变,LDH细胞毒性检测试剂盒检测LDH释放,ELISA检测IL-1β分泌。采用核质分离试剂盒分离细胞质和细胞核,RT-qPCR分别检测NBR2表达,采用荧光原位杂交（FISH）检测NBR2亚细胞定位。结果:加权基因共表达网络分析提示12个lncRNAs与GSDMD等细胞焦亡相关分子表达密切相关,其中4个lncRNAs在tLPS刺激的内皮细胞中的表达显著升高。通过si RNA分别干扰这4个lncRNAs表达,发现干扰lncRNA NBR2时,tLPS所致的内皮细胞焦亡形态改变明显减少,LDH释放显著减少,IL-1β分泌明显减少,GSDMD mRNA和蛋白表达均显著降低。NBR2包含1371个核苷酸,无蛋白编码能力,符合lncRNA的基本特征。FISH和核质分离检测结果表明NBR2在细胞核中表达高于细胞质中,tLPS刺激增强NBR2表达,促进NBR2向核内移位。过表达NBR2能够促进GSDMD mRNA和蛋白表达,促进内皮细胞焦亡、LDH释放、IL-1β分泌,而干扰GSDMD能够阻断NBR2促进GSDMD表达和细胞焦亡的作用。结论:lncRNA NBR2通过靶向调控GSDMD表达,介导脓毒症血管内皮细胞焦亡。第三章LncRNA NBR2靶向调控GSDMD基因表达的机制研究目的:探讨NBR2靶向调控GSDMD表达的分子机制。方法:首先通过RNA纯化染色质分离实验（ChIRP）捕获NBR2结合的蛋白质,联合液质联用串联质谱（LC-MS/MS）技术和Western Blot检测和验证NBR2结合的关键蛋白HNRNPK,通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）联合RT-qPCR验证NBR2和HNRNPK的相互作用。然后,采用含sh HNRNPK载体的慢病毒感染内皮细胞,同时给予tLPS刺激内皮细胞,RT-qPCR检测候选NBR2、HNRNPK和GSDMD表达,Western Blot或免疫荧光检测HNRNPK和GSDMD蛋白表达,观察内皮细胞焦亡形态,LDH细胞毒性检测试剂盒检测LDH释放,ELISA检测IL-1β分泌。再采用染色质免疫共沉淀（Ch IP）联合qPCR检测HNRNPK蛋白与GSDMD基因的相互作用,荧光素酶报告基因检测HNRNPK对GSDMD基因转录的调控作用。最后,使用干扰HNRNPK的慢病毒感染内皮细胞并予以tLPS刺激,通过FISH和免疫荧光检测NBR2与HNRNPK蛋白亚细胞分布和共定位情况,并利用核质分离,分别采用RT-qPCR检测细胞质和细胞核中NBR2的表达,Western Blot检测细胞质和细胞核中HNRNPK蛋白的表达。结果:ChIRP-MS检测到42个蛋白质可能与NBR2结合,同时筛选可能与GSDMD基因结合的蛋白,发现HNRNPK蛋白可能同时结合NBR2和GSDMD基因,ChIRP-Western Blot结合RIP-RT-qPCR结果双向证实HNRNPK与NBR2的相互作用。tLPS导致内皮细胞焦亡、LDH释放增多、IL-1β分泌增多,GSDMD表达增多;而干扰HNRNPK表达明显缓解内皮细胞焦亡、减少LDH释放、降低IL-1β水平,GSDMD表达减少,阻断NBR2促进GSDMD表达和细胞焦亡的作用。Ch IP-qPCR结果表明HNRNPK与GSDMD基因相互作用,荧光素酶报告基因结果表明HNRNPK结合到GSDMD基因上促进GSDMD基因转录,增强GSDMD表达。共定位实验表明,tLPS刺激NBR2和HNRNPK向细胞核内移位,干扰HNRNPK表达,NBR2核细胞移位减少。核质分离检测结果也证实tLPS刺激NBR2和HNRNPK向细胞核内移位,干扰HNRNPK表达,NBR2核细胞移位减少。结论:lncRNA NBR2招募并结合HNRNPK蛋白,转移至细胞核内,靶向调控GSDMD表达,介导胞内LPS引起的内皮细胞焦亡。