包虫病又可称为棘球蚴病,此病是一类严重的人兽共患寄生虫病,它严重危害了人类与家畜的健康,并对畜牧业造成了危害与阻碍。作为终末宿主的犬科动物,其粪样中会含有细粒棘球绦虫生长发育过程中的代谢物、节片、虫卵、分泌物等虫体组织,详细了解这些虫体组织的蛋白质组学,对细粒棘球绦虫检测工作有重要意义。本文通过对犬粪中靶抗原的筛选鉴定,为细粒棘球绦虫粪抗原ELISA检测方法中标准品的制备提供依据,并且通过对流行地区终末宿主感染细粒棘球绦虫情况的检测准确性,也能为综合防控措施的制定以及感染情况的控制提供技术支撑。本研究的结果与方法可以为以后筛选鉴定靶抗原,提高粪抗原ELISA检测试剂盒的敏感性与特异性提供重要经验和参考方法。方法:通过人工感染细粒棘球绦虫,收集感染后荷虫量高的犬粪样品,然后选取适合的缓冲液对粪样中的虫体抗原进行初步提取。再用多克隆血清与粪抗原结合形成抗原抗体结合物,利用饱和硫酸铵沉淀以及层析柱对抗原抗体结合物进行纯化与分离。最后用双向电泳筛选鉴定靶抗原。结果:（1）PBST缓冲溶液对可溶性蛋白的析出优于硼酸硼砂缓冲溶液和Tris-HCl缓冲溶液。（2）抗原抗体结合最佳浓度在溶液体积不变情况下,多克隆血清占比60%～70%与粪抗原结合;若经过饱和硫酸铵沉淀后,抗原抗体结合最佳浓度为多克隆血清占比5%～20%与粪抗原结合。（3）抗原抗体结合物通过亲和层析柱后其性质不会发生改变,并且抗原抗体结合物通过凝胶层析后在时间段45.5～50.5 min附近出峰并接收的样品中含所需要的抗原抗体结合物。（4）双向电泳的IPG胶条为7 cm pH 3～10和7 cmpH4～7得到的双向电泳图,有部分区域形成点状或连点状的斑块。IPG胶条为7 cm pH 4～7的Western Blot结果显示有特异性蛋白位点。结论:PBST缓冲溶液相对于Tris-HCl缓冲溶液和硼酸硼砂缓冲溶液,能够更多的将粪样中虫体分泌可溶性蛋白析出。抗原抗体最佳结合浓度选用溶液体积不变情况下,多克隆血清占比20%与粪抗原结合。抗原抗体结合物通过凝胶层析柱在时间段45.5～50.5 min附近接收的样品中含有纯化的抗原抗体结合物。通过这些方法探索细粒棘球绦虫在终末宿主排泄物中分泌抗原与抗体的免疫结合位点,可以为今后开展棘球蚴免疫预防与检测提供参考经验。

旋毛虫（Trichinella spiralis）和弓形虫（Toxoplasma gondii）是两种重要的食源性寄生虫,具有相似的感染途径和宿主范围。由于两种病原分别属于多细胞的线虫和单细胞的原虫,因此它们感染宿主后诱导的免疫应答也截然不同。旋毛虫感染宿主诱导Th2型为主的免疫应答,弓形虫感染宿主诱导Th1型为主的免疫应答。众所周知,巨噬细胞在调节Th1和Th2型免疫应答方面发挥关键作用。两种病原的共感染改变了宿主对每种病原的免疫应答反应,进一步增加了对食品安全和人类健康的威胁。阐明旋毛虫与弓形虫感染同一宿主的致病机理和免疫机制是防控两种病原共感染的重点。本研究旨在探究由旋毛虫活化巨噬细胞诱导产生的Th2型免疫应答对弓形虫再感染的调节作用,明确旋毛虫诱导活化巨噬细胞介导Th2型免疫应答调节弓形虫再感染的分子机制,为防控旋毛虫和弓形虫感染同一宿主奠定理论基础。本研究建立了旋毛虫-弓形虫同时感染、旋毛虫先期感染-弓形虫继发感染和弓形虫先期感染-旋毛虫继发感染BALB/c小鼠模型。通过ELISA方法检测了共感染小鼠外周血Th1和Th2型细胞因子水平的变化;利用流式细胞技术评价了共感染小鼠外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞变化情况;显微镜计数方法检测了共感染小鼠旋毛虫荷虫量;q RT-PCR方法检测了共感染小鼠弓形虫荷虫量。结果显示单独旋毛虫感染主要诱导以Th2型细胞因子（IL-4）升高和CD4+T细胞增加为标志的Th2型免疫应答;单独弓形虫感染主要诱导以Th1型细胞因子（IFN-γ）升高和CD8+T细胞升高为标志的Th1型免疫应答;旋毛虫与弓形虫同时感染诱导Th1/Th2型混合免疫应答,且弓形虫感染可以推迟旋毛虫感染诱导的Th2型细胞因子达到峰值的时间,旋毛虫感染可以推迟弓形虫感染诱导的Th1型细胞因子达到峰值的时间;旋毛虫感染6周后弓形虫继发感染,诱导比旋毛虫单独感染时较低的CD4+T细胞和较高的CD8+T细胞为特征的免疫应答;弓形虫感染6周后旋毛虫继发感染诱导比弓形虫单独感染较高的CD4+T细胞和较高的CD8+T细胞为特征的免疫应答;旋毛虫和弓形虫共感染小鼠与单独寄生虫感染小鼠相比,尽管无法显著改变旋毛虫荷虫量,但可以显著增加弓形虫荷虫量。以上研究结果表明旋毛虫感染诱导与弓形虫感染截然相反的免疫应答,即旋毛虫感染主要诱导抑制炎症反应的Th2型免疫应答,弓形虫感染主要诱导促进炎症反应的Th1型免疫应答;旋毛虫/弓形虫共感染时,诱导的两种免疫应答相互影响,互相拮抗,即旋毛虫感染诱导的免疫应答可以抑制弓形虫感染诱导的免疫应答;旋毛虫感染可以促进弓形虫的感染,但是弓形虫感染无法显著影响旋毛虫的感染。旋毛虫通过哪些分子调节宿主免疫应答影响弓形虫感染尚未明确。前期研究表明,旋毛虫可以通过ES抗原调节宿主Th2型免疫应答。本研究鉴定了旋毛虫ES抗原成分之一——硫氧还蛋白过氧化物酶（thioredoxin peroxidase,TPX2）,并初步明确了旋毛虫TPX2通过活化巨噬细胞诱导小鼠Th2型免疫应答的机制。采用免疫组化和免疫荧光方法研究了TPX2蛋白在旋毛虫肌幼虫和成虫中的定位;以r TSTPX2蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA方法检测了血清中细胞因子和特异性抗体变化,流式细胞技术检测了外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞含量,攻虫实验评价r Ts TPX2免疫保护效果;采用q RT-PCR和Western Blotting方法检测TPX2体外诱导活化的腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞的表型;利用MTS法评价了r Ts TPX2活化的巨噬细胞体外刺激CD4+T细胞的增殖能力;将r Ts TPX2体外活化的腹腔巨噬细胞移植至健康BALB/c小鼠,通过ELISA方法检测了血清中细胞因子和特异性抗体变化,流式细胞技术检测了外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞含量,攻虫实验评价移植r Ts TPX2活化的巨噬细胞诱导的免疫保护效果。结果显示旋毛虫TPX2主要分布于旋毛虫肌幼虫和成虫的表皮层和杆状体中,少量分布于肌幼虫和成虫寄生部位的周围宿主组织中;以r Ts TPX2直接免疫小鼠可以诱导以Th2型细胞因子（IL-4和IL-10）增加、Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-12和TNF-α）降低、Th2型特征性抗体（Ig G1）大量分泌为特征的Th2型为免疫应答,同时伴随CD4+T细胞的增加和CD8+T细胞的降低。并且r Ts TPX2诱导的上述免疫应答可以引起约35%成虫减虫率和45%肌幼虫减虫率。体外研究显示,r Ts TPX2可以直接诱导腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞分化成M2表型,表现为M1（i NOS-1）标志分子表达下调和M2（MRC-1、Arg-1、CCL22）标志分子表达上调;体外巨噬细胞/CD4+T细胞共培养模型显示,r Ts TPX2活化的巨噬细胞可以直接诱导CD4+T细胞极化为Th2并大量增殖;将r Ts TPX2体外活化的巨噬细胞过继小鼠,可以诱导Th2型增强为特征的免疫应答,攻虫实验表明,r Ts TPX2活化的巨噬细胞可诱导44.7%的成虫减虫率和52.9%的肌幼虫减虫率。以上结果表明,旋毛虫TPX2可通过诱导M2亚群巨噬细胞活化进而抑制Th1型免疫应答而发挥抗旋毛虫感染作用。巨噬细胞是抗胞内病原感染重要效应细胞,在抗弓形虫天然免疫中发挥关键作用,旋毛虫诱导活化的巨噬细胞是否影响弓形虫感染?本研究进一步探究了旋毛虫诱导巨噬细胞活化以及诱导活化的巨噬细胞对弓形虫体外感染的影响。通过q RT-PCR和WB方法检测了体内和体外活化的巨噬细胞标志分子,明确了旋毛虫诱导活化的巨噬细胞表型;通过弓形虫速殖子体外感染巨噬细胞,明确不同活化方式的巨噬细胞对弓形虫感染的影响。结果显示体内旋毛虫感染诱导巨噬细胞以Arg-1、Fizz-1和MRC-1表达上调为标志的M2表型;旋毛虫肌幼虫ES抗原和r TSTPX2体外刺激RAW264.7和腹腔巨噬细胞,诱导以Arg-1和MRC-1上调,i NOS-1下调为标志的M2表型;M2表型的巨噬细胞可以增加弓形虫感染。表明旋毛虫可以通过直接诱导巨噬细胞替代途径活化调节弓形虫感染。综上所述,本研究初步阐明了旋毛虫诱导Th2型免疫应答的分子机制,明确了旋毛虫诱导的Th2型免疫应答对弓形虫感染的影响,初步确定了旋毛虫通过诱导巨噬细胞活化调节弓形虫感染的细胞机制。

旋毛虫（Trichinella spiralis）是一种典型的人兽共患寄生线虫,其引发的旋毛虫病是一种世界广泛分布的食源性寄生虫病。目前的诊断方法主要为集样消化法和ELISA检测方法。肌幼虫排泄分泌产物（ES）为应用最广泛的诊断抗原,但具有期特异性且成分复杂。旋毛虫相关蛋白可引发宿主Th2型免疫反应,造成宿主的免疫抑制,进而形成慢性感染导致长期寄生,现阶段该反应机理尚不清楚。旋毛虫ES成分复杂,包含多种蛋白酶:丝氨酸蛋白酶、谷胱甘肽转移酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等。因此,旋毛虫ES相关抗原分子的分离、鉴定及其抗原性和免疫调节性的研究对于旋毛虫病免疫学检测方法的建立及疫苗研制非常重要。本实验室前期构建了旋毛虫3日龄成虫的c DNA文库,经过免疫学方法筛选得到高丰度与强免疫反应性的丝氨酸蛋白酶基因Ts-Sp-7（Gen Bank登录号EU263332.1）。本研究基于该基因对Ts-Sp-7蛋白抗原性及免疫调节性进行研究。参照Gen Bank公布的Ts-Sp-7基因序列,设计特异性引物,收取感染3天的旋毛虫成虫阶段的总RNA,反转录获取目的序列,常规PCR扩增,并构建原核表达载体p ET28a-Ts-Sp-7,原核表达。SDS-PAGE结果显示,在47 k Da左右呈现一条蛋白条带,与理论值47.5 k Da一致,收获复性纯化后的Ts-Sp-7蛋白。Western-Blot结果显示,该蛋白能够与10000条/头感染剂量不同感染天数（15dpi、30 dpi、45 dpi、60 dpi、90 dpi、120 dpi）的猪阳性血清发生特异性反应。结果可知,纯化后的目的蛋白具备良好的反应原性。其次,采用变性纯化的Ts-Sp-7蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗Ts-Sp-7蛋白兔多克隆抗体。用间接ELISA测得该多抗效价是1:350000。由间接免疫荧光结果可以看出,相对于兔阴性血清对照组,Ts-Sp-7蛋白多抗作为一抗的肌幼虫表皮有很强烈的红色荧光信号。采用变性纯化Ts-Sp-7蛋白免疫BABL/c小鼠,复性纯化的重组Ts-Sp-7蛋白及ES进行筛选,收获稳定分泌抗Ts-Sp-7蛋白抗体的杂交瘤细胞株。经过3次亚克隆,收获了5株杂交瘤细胞株,可以稳定地分泌抗Ts-Sp-7蛋白抗体。竞争ELISA结果显示,猪阳性血清能够抑制其中两株单抗与重组Ts-Sp-7的结合,命名为H4H7-2A4、H8D12-5B9。Western-Blot结果显示纯化后的两株单抗均能特异性地识别虫体蛋白。亚型鉴定显示,H4H7-2A4抗体为Ig G2a亚类,κ亚型;H8D12-5B9抗体Ig G2b亚类,λ亚型。以Ts-Sp-7基因序列为模板,设计3对引物,对Ts-Sp-7蛋白进行分段截短表达。Western-Blot结果表明,两株单抗都能够特异性地识别Ts-Sp-7-2蛋白。进而利用Pep Scan技术合成8个短肽,进行间接ELISA鉴定。确定H4H7-2A4所识别抗原表位位于W5肽段,氨基酸序列为222 GVDRSATCQGDSGGP236。H8D12-5B9所识别抗原表位位于W7肽段,氨基酸序列为252PPTCGDARHSVKFAKVP268。多克隆抗体和竞争性单克隆抗体的成功制备为建立基于Ts-Sp-7蛋白的旋毛虫感染诊断试剂奠定了基础。从小鼠骨髓源细胞里分离提取到树突状细胞（BMDCs）,体外对其诱导分化,形成未成熟状态的BMDCs,设立Ts-Sp-7蛋白单独作用组、LPS阳性对照组以及PBS阴性对照组,分别刺激BMDCs,利用流式细胞术分析目的蛋白对BMDCs成熟活化的影响。结果显示,Ts-Sp-7蛋白可诱导BMDCs表面分子CD86的表达,对MHCⅡ类分子的表达无显著影响,表明Ts-Sp-7蛋白可促进BMDCs的成熟。进而从OVA抗原特异性转基因小鼠（OT-II）脾脏内分离提取到Na?ve CD4+T细胞,和Ts-Sp-7蛋白预先刺激的BMDCs建立共培养体系,在OVA抗原刺激的前提下,检验Na?ve CD4+T细胞活化、增殖和分化的情况。结果表明Ts-Sp-7蛋白可促进Na?ve CD4+T细胞的明显增殖。可促进效应T细胞表面分子CD44和CD62L的表达,促进效应T细胞活化为可以参与淋巴细胞再循环的效应T细胞。Ts-Sp-7蛋白孵育的BMDCs可诱导Na?ve CD4+T细胞向Treg型分化,推测TsSp-7蛋白是具有免疫调节性的重组蛋白,可能参与宿主免疫调控。综合以上实验结果,Ts-Sp-7蛋白具备良好的抗原性及免疫调节性,可作为旋毛虫的诊断抗原及调控分子,在旋毛虫诊断方法的建立及宿主免疫反应的调节过程中发挥重要功能。

为进一步掌握细粒棘球蚴病在新疆阿勒泰、昌吉、伊犁和喀什四个地区（州）牛羊中的流行状况,明确流行株的遗传差异性,本研究通过PCR扩增细粒棘球绦虫线粒体基因组cox1基因片段和nad5基因片段,然后对扩增产物进行测序和基因多态性分析,旨在获取相应遗传学差异信息。对新疆阿勒泰、昌吉、伊犁和喀什四地区（州）的部分牛羊屠宰场进行细粒棘球蚴病流行病学调查,筛查了352头牛和5202只绵羊,共采集4头牛和116只绵羊的疑似感染包囊样本,其中1头牛和35只绵羊可分离原头蚴,喀什绵羊的感染强度最高,最多1只绵羊采集的包囊样本可达到32个包囊。用长度为1649bp的线粒体基因组cox1基因片段对来自3头牛和96只绵羊的156个包囊样本获得PCR扩增。对目的片段进行聚类分析发现,这些包囊样本均为细粒棘球绦虫G1基因型（Echinococcus granulosus G1）,共有53个不同的单倍型,同源性为99.7%～100%;发现57个位点核苷酸发生碱基置换,约占分析位点总数的3.46%,序列间差异值在0%～0.3%之间;分离株核苷酸序列所有突变中只存在转换和颠换,没有缺失或插入,并且转换数明显多于颠换数,其中有52个碱基转换位点,3个碱基颠换位点,2个位点发生碱基转换和颠换。用长度为680bp的线粒体基因组nad5基因部分片段对来自3头牛和86只绵羊的129包囊样本获得PCR扩增。对目的片段进行聚类分析,得到了与cox1基因一致的结果,确定均为G1基因型,共有24个不同的单倍型,同源性为99.56%～99.85%;发现24个位点核苷酸发生碱基置换,约占分析位点总数的3.53%,序列间差异值在0%～0.44%之间;分离株核苷酸序列所有突变中只存在碱基转换,未发生颠换、缺失或插入。对该调查采集的疑似包囊样本,经PCR扩增cox1和nad5基因,3头牛和97只绵羊鉴定为感染细粒棘球蚴病,其中昌吉的感染率最高,约为3.69%;其次是喀什,感染率为1.85%;再次是伊犁,感染率为1.46%;感染率最低的是阿勒泰,约为0.68%。对感染部位进行统计发现肝脏感染率比肺脏高,肝脏感染率为1.06%,肺脏感染率为0.74%。本研究揭示单个宿主可以感染多个单倍型,同时表明同一宿主可感染不同的虫株。本研究明确了新疆阿勒泰、昌吉、伊犁和喀什四地区（州）细粒棘球蚴的基因型,掌握了这些地区细粒棘球蚴病的分子流行病学资料,为制定有效的防控措施提供科学依据。

环状RNA（circular RNA,circRNA）是由反向剪接（back-splicing）过程产生的共价闭合环状RNA。具有在真核生物中含量丰富,进化上保守,呈现组织特异性表达,高度稳定,可在神经组织中随衰老而累积等特点。circRNA可以通过竞争剪接方式与其对应的线性RNA产物进行顺式调节。棘球蚴病（echinococcosis）俗称包虫病（hydatidosis/hydatid disease）,是由棘球属（Echinocococcus）绦虫的幼虫寄生于人和动物的肝脏、肺脏等组织器官而引起的一种重要的人兽共患寄生虫病。由多房棘球绦虫（E.multilocularis,Em）的幼虫即多房棘球蚴引起的疾病称多房棘球蚴病（alveolar echinococcosis,AE）又名泡型棘球蚴病或泡型包虫病,是一种广泛分布于北半球的人兽共患寄生虫病,为自然疫源性疾病。每年大约新增患者17,400例,其中大部分发生在中国。多房棘球蚴可以寄生于中间宿主的肝、肺等组织器官,像恶性肿瘤一样,从组织器官向体腔内蔓延生长,故多房棘球蚴病又称为“虫癌”。它危害宿主的方式主要是通过夺取宿主营养物质、机械性损伤宿主组织器官,对宿主的毒性作用,宿主机体对其产生慢性免疫反应和炎症反应等。同时,因为患者早期无明显的临床症状,所以此类疾病的早期诊断比较困难。研究多房棘球蚴感染小鼠肝脏组织早期特异性或差异性表达circRNA及其ceRNA（competing endogenous RNAs,内源竞争性RNA）网络,旨在为进一步揭示多房棘球蚴感染后引起宿主体内circRNA的变化趋势及探索作为疾病诊断、预后的稳定而灵敏的新型分子生物学标志物的潜力,阐明circRNA的功能与分子作用机制,以及为提高多房棘球蚴病的诊疗水平等奠定基础和提供依据。本论文的主要研究内容和结果如下:1.通过对感染多房棘球蚴小鼠肝脏和未感染小鼠肝脏组织的高通量测序与分析比较,筛选差异表达的circRNA。经生物信息学分析筛选出差异表达的circRNA,根据丰度较高及差异倍数大的原则,选择4个上调表达的circRNA和2个下调表达的circRNA,通过qRT-PCR（quantitative real-time PCR,实时定量PCR）验证其表达趋势是否与高通量测序结果一致,RT-PCR（reverse transcription PCR,反转录PCR）后的Sanger测序验证靶标circRNA的环化位点是否正确。测序结果,上调表达的circRNA基因有201个,下调表达的circRNA基因有9个,差异表达共计210个,实时荧光定量PCR验证出4个上调和2个下调差异circRNA的变化趋势与芯片结果一致。验证出6个差异表达的circRNA,证明高通量测序结果是可信的。利用Sanger测序验证出1个circRNA的剪切位点是合适的。2.对筛选的差异表达circRNA进行生物信息学分析,构建circRNA的circRNA-miRNAmRNA互作网络,体现circRNA的ceRNA的作用机制。差异表达circRNA的GO（Gene Ontology,基因本体论）富集分析显示,在分子功能、生物过程及细胞组分均有富集;KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书）富集通路分析表明,有内吞作用、SNARE蛋白相关囊泡运动、矿物质吸收等与免疫相关的信号通路。基于芯片qRT-PCR验证结果,采用生物信息学方法,分析感染多房棘球蚴小鼠和对照组肝脏差异表达的circRNA可能结合的miRNA,从circRNA调控的角度探讨多房棘球蚴在宿主体内可能的致病机制。最后,构建了5个候选circRNA分子的circRNA-miRNA-mRNA网络图,为下一步深入研究多房棘球蚴感染宿主中差异表达的circRNA相关功能提供了重要线索。综上所述,本研究初次进行多房棘球蚴感染宿主的circRNA高通量测序,初步探索了circRNA在感染早期发生的变化。验证芯片测序结果可信,确定了2个circRNA的剪切位点,对5个候选circRNA进行了ceRNA可能作用网络的分析,探讨其可能作用的靶分子,为今后深入研究circRNA在宿主多房棘球蚴病致病中的作用与分子机制等奠定前期基础和提供参考依据。

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种人畜共患寄生原虫,呈世界性分布。作为单细胞寄生虫,它几乎可以感染所有的温血动物。弓形虫通过侵染宿主有核细胞,从而引起宿主多种组织、器官发生损害和病变。据统计,全球有超过1/3的人口感染弓形虫病。除了人类,弓形虫还能感染200多种动物并致其发病,其中猫科动物为弓形虫唯一终末宿主,猪的弓形虫感染率最高。中国作为生猪养殖大国,弓形虫感染率在4.8%～85.7%之间,且地域差异较大,该病大规模在猪群及畜禽厂中的传播,给畜牧业尤其生猪养殖业造成重大的经济损失。同时我国也是猪肉消费大国,猪作为弓形虫重要的中间宿主,在弓形虫的传播过程中起到十分重要的作用。因此,建立一种快速准确的实验室检测方法是防控弓形虫病的重要措施之一,对保护实际生产起非常重要的作用。本研究利用实验室保存的质粒pET-28a-GRA7原核表达了重组GRA7蛋白,通过试验证明该重组蛋白具有良好特异性;免疫BALB/c小鼠,取脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法进行杂交瘤细胞的筛选,通过复检与亚克隆后选取了4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,命名为A3D,B6G,F9B及KIF,其中B6G细胞培养上清的抗体效价最高,为2.24×10~5。Western Blot和IFA实验证明四株单克隆抗体均能与重组GRA7蛋白发生特异性反应,具有良好的特异性,最终选择单克隆抗体B6G进行阻断ELISA方法建立。逐步优化阻断ELISA的最佳反应条件,经过特异性试验和重复性试验,发现所建立的阻断ELISA方法具有特异性强,符合率高和重复性好的特点,用该方法对临床288份临床样品进行检测,发现该批样品中的弓形虫抗体阳性率为11.46%,与MAT复检阳性重合率为84.9%,表明该方法能用于临床样品中弓形虫抗体的检测。

微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）是一种重要的人兽共患肠道寄生虫,可导致婴幼儿、新生动物和免疫缺陷个体的严重腹泻,甚至死亡。它是造成全球2岁以内儿童致死性腹泻的第二大病因,也是引起1月龄内犊牛腹泻的主要原因。目前被批准的可用于治疗隐孢子虫病的药物仅有硝唑尼特,但该药物在健康个体中仅有56%～96%的疗效,在免疫功能缺陷或婴幼儿个体中没有疗效,目前尚没有用于预防隐孢子虫感染的疫苗。环状RNA（circular RNA,circRNA）可在不同水平上调控基因的表达,参与各种生理和病理过程。研究显示,包括隐孢子虫在内的多种寄生虫感染可导致宿主circRNAs的显著差异表达,但关于这些显著差异表达circRNAs（differentially expressed circRNAs,DE circRNAs）的功能仍然未知。基于此,本研究利用微阵列芯片（microarray）技术检测了C.parvum感染24 h的HCT-8细胞中的circRNAs表达谱,筛选出DE circRNAs,应用实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）、过表达和干扰技术、免疫印迹（western blot）、双荧光素酶报告基因等试验方法,探究了circRNA在C.parvum感染HCT-8细胞中的调节作用及潜在的调控机制,获得了以下研究结果:1.获得了C.parvum感染的HCT-8细胞中的circRNAs表达谱:对C.parvum感染HCT-8细胞24 h的样品进行microarray分析发现,共有178个DE circRNAs[fold change（FC）＞2、P＜0.05],包括128个上调和50个下调的circRNAs;对DE circRNAs的来源基因进行GO富集分析,发现它们富集于重要的生物学过程和分子功能;对DE circRNAs的来源基因进行KEGG通路分析,发现它们富集于重要的信号通路,特别是代谢通路。2.发现上调表达的circRNA ciRS-7显著促进C.parvum在HCT-8细胞中的增殖:circRNA ciRS-7（hsa＿circ＿0001946＿CBC1,又称为CDR1as）在microarray结果中显著上调（FC=7.96530932、P＜0.05）;q RT-PCR分析发现,HCT-8细胞中ciRS-7的表达水平在感染后12 h（12 h post infection,12 h pi）～48 h pi显著升高;过表达ciRS-7显著促进感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平;而干扰ciRS-7表达的作用相反。3.获得了circRNA ciRS-7的潜在靶miRNAs:利用star Base v3.0预测到ciRS-7共有22个潜在的靶miRNAs;q RT-PCR分析发现,HCT-8细胞中miR-1270、miR-219a-5p、miR-135b-5p、miR-135a-5p、miR-139-3p、miR-601和miR-7的表达水平在24 h pi显著降低;过表达ciRS-7显著降低感染细胞中miR-1270、miR-219a-5p、miR-135b-5p、miR-135a-5p和miR-139-3p的表达水平,而干扰ciRS-7的表达显著升高感染细胞中miR-1270、miR-219a-5p、miR-135b-5p、miR-135a-5p和miR-7的表达水平;双荧光素酶报告基因试验发现,在HCT-8细胞中ciRS-7和miR-1270、miR-219a-5p以及miR-135a-5p存在结合作用。由此可见,在HCT-8细胞中,ciRS-7可靶向结合miR-1270、miR-219a-5p以及miR-135a-5p。4.发现circRNA ciRS-7靶向miR-1270调控NF-κB信号通路影响C.parvum在HCT-8细胞中的增殖:预测并证实了miR-1270和核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）信号通路的亚基rel A（p65）基因的3’非翻译区（3’-untranslated region,3’-UTR）在HCT-8细胞中存在结合作用;HCT-8细胞中rel A基因的mRNA表达水平在12 h pi～48 h pi显著升高,且RELA蛋白质的表达水平在24 h pi显著升高,NF-κB信号通路下游因子nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平在24 h pi也显著升高;转染miR-1270 mimics显著抑制感染细胞中rel A基因的mRNA和蛋白质表达水平以及nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平,而miR-1270 inhibitor的作用相反;过表达ciRS-7显著促进感染细胞中rel A基因的mRNA和蛋白质表达水平以及nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平,而干扰ciRS-7表达的作用相反;miR-1270 mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中的rel A以及nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平的上调作用。进一步研究发现,miR-1270 mimics显著抑制感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平,而miR-1270 inhibitor的作用相反;miR-1270 mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平的上调作用。5.发现circRNA ciRS-7靶向miR-135a-5p调控STAT1和p-STAT1的表达影响C.parvum在HCT-8细胞中的增殖:预测并证实了miR-135a-5p和信号传导及转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription1,stat1）基因的3’-UTR区在HCT-8细胞中存在结合作用;HCT-8细胞中stat1基因的mRNA表达水平在12 h pi～72 h pi显著上调,且STAT1和磷酸化STAT1（p-STAT1）的蛋白质表达水平在24 h pi显著上调;转染miR-135a-5p mimics显著抑制感染细胞中STAT1和p-STAT1的蛋白质表达水平,而miR-135a-5p inhibitor的作用相反;过表达ciRS-7显著促进感染细胞中STAT1和p-STAT1的蛋白质表达水平,而干扰ciRS-7表达的作用相反;miR-135a-5p mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中STAT1和p-STAT1蛋白质表达水平的上调作用。进一步研究发现,虽然miR-135a-5p mimics不影响感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平,但miR-135a-5p inhibitor显著上调了感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平;miR-135a-5p inhibitor逆转了干扰ciRS-7的表达时对感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平的下调作用。6.发现circRNA ciRS-7靶向miR-219a-5p调控细胞自噬影响C.parvum在HCT-8细胞中的增殖:HCT-8细胞中自噬关键蛋白LC3B-II和p62的蛋白质表达水平在8 h pi～48 h pi显著增加,表明C.parvum感染诱发了HCT-8细胞的不完全自噬;转染miR-219a-5p mimics显著增加了感染细胞中LC3B-II的蛋白质表达水平但降低了p62的蛋白质表达水平,而miR-219a-5p inhibitor的作用相反;过表达ciRS-7显著降低了感染细胞中LC3B-II的蛋白质表达水平但升高了p62的蛋白质表达水平,而干扰ciRS-7表达的作用相反;miR-219a-5p mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中LC3B-II蛋白质表达的抑制和p62蛋白质表达的促进作用;预测发现miR-219a-5p有16个与自噬通路相关的潜在靶基因,其中akt1、pik3ca和p62基因的mRNA表达水平在感染细胞中显著升高,但miR-219a-5p与akt1、pik3ca和p62基因在HCT-8细胞中均不存在结合作用,提示ciRS-7/miR-219a-5p轴可能通过其他机制调节C.parvum感染HCT-8细胞的自噬。进一步研究发现,miR-219a-5p mimics显著抑制了感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平,而miR-219a-5p inhibitor的作用相反;miR-219a-5p mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中C.parvum hsp70基因的mRNA表达水平的上调作用。综上所述,C.parvum感染导致HCT-8细胞的circRNAs表达谱的显著改变,显著上调表达的circRNA ciRS-7可通过靶向miR-1270、miR-135a-5p和miR-219a-5p分别调控NF-κB信号通路、STAT1和p-STAT1的表达和细胞自噬来促进C.parvum在HCT-8细胞中的增殖。研究初步揭示了宿主circRNA ciRS-7在隐孢子虫感染中的作用,为进一步厘清隐孢子虫感染和致病机制提供了新思路。

猪带绦虫是主要的食源性寄生虫之一,其被确定为重点研究和控制的人兽共患病之一,与此同时也被世界卫生组织列为“17个被忽略的热带疾病之一”。猪带绦虫发育的不同阶段对宿主影响较为复杂,主要通过虫卵或孕节在环境和宿主之间传播,并且易感宿主和感染宿主伴有炎症反应,虫卵或孕节在宿主体内不同部位寄生,成虫寄生于人的肠道内,其他部位则以囊尾蚴阶段存在,引起炎症反应,囊尾蚴逐渐长大通过形成囊泡,使得炎症反应逐渐消失,逃避免疫机制。猪囊尾蚴病在人体内潜伏期较长,寄生部位不同轻则造成残疾、引起视觉障碍;重则引起共济失调和癫痫等大脑疾病。在中国,猪囊尾蚴病的流行主要分布在在中国东北地区、西南地区、偏远山区,地里位置、经济欠发达、交通不便等不利条件局限了猪囊尾蚴病诊断,借助蛋白质组学技术寻找猪囊尾蚴和患者血清中的共同蛋白,以期解决目前偏远地区猪囊尾蚴病感染确诊难的囧境。Label-free定性技术是基于质谱分析蛋白质组学的研究方法,适用于样品量小或样品稀缺物种的蛋白质组学研究。为了寻找出猪囊虫与猪囊虫病患者血清,二者之间的共同蛋白,首先利用高效液相色谱-串联质谱系统对虫体和患者血清进行全蛋白定性分析,然后筛查到猪源囊尾蚴虫体和患者血清的共有蛋白。结果表明,人感染猪囊虫后,囊虫蛋白刺激宿主机体产生免疫应答。通过基因本体论（GO）、直系同源簇（COG）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集等分析猪源囊虫和患者血清蛋白质组学,富集到参与细胞内进程、单体进程、生物学调节等蛋白,主要参与补体与凝血级联、磷酸戊糖途径、ECM-受体相互作用等信号通路。通过预测虫体蛋白质结构域（Domain）,发现囊虫结构保守结构域Histone H2A/H2B/H3的基因和Histone-fold Domain。高效液相色谱-串联质谱系统鉴定分析,猪源囊虫与患者血清有1个共有蛋白,即A0A0R3X5M7蛋白。为验证Lable-free鉴定结果的准确性,选择原核表达系统将共有蛋白诱导表达,进一步纯化,使用ELISA方法验证蛋白质组学结果,利用Western-blot技术复检ELISA结果。Western-blot结果显示猪亚洲带绦虫、猪旋毛虫、猪华支睾吸虫等血清检测结果呈阳性,与ELISA结果符合率100%。Lable-free蛋白质组学研究筛查出的蛋白A0A0R3X5M7是猪囊尾蚴和患者的共有蛋白,但是其不可作为诊断标识诊断猪囊尾蚴病。本实验为蛋白质组学其他技术研究猪带绦虫对宿主机体的影响和筛查猪囊尾蚴病诊断抗原奠定基础。

猪囊尾蚴病（Cysticercosis）是由猪带绦虫（Taenia solium）的幼虫-猪囊尾蚴（Cysticercus cellulose）引起的一种人兽共患食源性寄生虫病,该病严重危害着人和动物的健康,甚至可导致死亡。猪囊尾蚴病在世界范围内仍然流行的重要原因为虫体侵入过程中的免疫逃避现象,丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,serpin）在虫体入侵过程中扮演重要角色,猪囊尾蚴表达的serpin通过调节或抑制内源性和外源性蛋白酶作用,使虫体逃避宿主的免疫攻击。本研究以猪囊尾蚴丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin B6和serpin 4848蛋白为研究对象,通过分子生物学、生物信息学、免疫学等技术和方法,探究serpin参与或介导免疫逃避的可能性,目标为阐明虫体免疫逃避机制。通过生物信息学分析对serpin B6和serpin 4848基因进行分析;利用分子生物学方法与技术,表达了猪囊尾蚴serpin B6和serpin 4848重组可溶性蛋白,并进行纯化;采用发色底物法,验证酶活性抑制试验;通过凝血试验,探究serpin B6和serpin 4848蛋白参与凝血级联反应的可能;通过免疫组织化学方法,对serpin B6和serpin 4848蛋白进行囊尾蚴虫体组织学定位。生物信息学分析结果显示:serpin B6和serpin 4848不含信号肽序列和跨膜结构,进化树分析显示与多房棘球绦虫serpin亲缘关系最近可能具有相似的生物学功能。原核表达并纯化了serpin B6和serpin 4848两种蛋白,Western blot结果显示可与猪囊尾蚴病阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性,可为猪囊尾蚴病的筛查及诊断提供新思路;酶活性抑制试验表明serpin B6和serpin 4848皆可与胰蛋白酶这种哺乳动物消化酶类反应并抑制其活性,且具有浓度依赖性。14μg/m L浓度下,serpin B6抑制率可达79.36%,serpin 4848抑制率可达87.56%。推测这两种蛋白在寄生虫进入肠道阶段可起到免疫逃避作用;凝血试验APTT和PT数据结果表明serpin B6和serpin 4848均不参与凝血级联反应。成功制备兔多克隆抗体血清,采用ELISA方法测定抗体效价,抗体滴度均达到1:128000。免疫组化试验表明,serpin B6和serpin 4848在猪囊尾蚴中均有表达,但表达量不高,分别在吸盘和纤维层区有表达,且在吸盘处serpin4848较serpin B6表达量高。推测这两种蛋白可能参与虫体的摄取营养及促进虫体的新陈代谢。

刚地弓形虫是一种顶复门原虫,其感染宿主非常广泛。研究表明弓形虫在寄生过程中,不仅能够调节宿主基因的表达,而且还可以改变自身的代谢等生物过程以适应不同的寄生环境。弓形虫与宿主的互作研究主要以模式动物小鼠为主,然而越来越多的证据表明不同宿主感染弓形虫后的病原-宿主互作机制不尽相同。猪是弓形虫的易感宿主,感染后导致母猪流产、死胎等,造成巨大的经济损失。然而目前关于猪与弓形虫互作的研究还非常有限。本研究以猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）为宿主细胞,选取弓形虫Me49虫株作为代表虫株,利用Dual RNA-seq技术进行互作转录组分析。我们的结果揭示了猪肺泡巨噬细胞感染弓形虫后独特的应答反应,同时我们还发现弓形虫适应胞内寄生生活的代谢途径并对其中两个（II型脂肪酸合成与磷酸盐的吸收）在虫体生长繁殖中生理功能进行了研究,主要内容如下:（1）互作转录组数据分析对获得的高质量测序数据分析表明猪肺泡巨噬细胞感染弓形虫以后虫体与宿主的转录谱均发生显著改变,猪肺泡巨噬细胞中上调基因主要与免疫应答相关,下调基因主要集中在细胞连接。对差异表达基因进行细致分析揭示了猪巨噬细胞与小鼠巨噬细胞响应弓形虫感染的差别。II型虫株可以诱导小鼠巨噬细胞上调IL-12基因转录水平,产生大量的IL-12;而猪肺泡巨噬细胞IL-12基因的转录水平在感染前、后没有发生变化,而且表达水平极低。同时,实验表明猪肺泡巨噬细胞产生NO的能力有限,NO可能不是猪巨噬细胞抵抗弓形虫感染的效应分子。此外,数据表明弓形虫对猪肺泡巨噬细胞凋亡具有抑制作用。弓形虫进入宿主细胞后上调基因的KEGG通路分析表明虫体核糖体活动增强,GO分析显示弓形虫代谢活性增强,II型脂肪酸合成途径（FASⅡ）中大多数酶在虫体进入宿主细胞后表达显著上升,多个潜在转运蛋白的表达量也显著上调,说明虫体进入宿主细胞后代谢活性明显提高,为生长复制奠定物质基础。（2）II型脂肪酸合成途径（FASⅡ）与哺乳动物宿主相比,FASⅡ是顶复门原虫特有的脂肪酸合成途径,参与其中的酶都定位于顶质体中,但它在虫体中扮演的角色不十分明确,我们的转录组学就发现FASⅡ途径相关基因的表达量在虫体进入宿主细胞后显著上调,这个结果也得到了q RT-PCR验证。本研究选取FASⅡ中的Fab D蛋白开展研究。结果表明敲除Tg Fab D基因造成弓形虫生长减慢,但不影响其入侵、逸出,更重要的是它的缺失不影响虫株的急性毒力,说明FASⅡ扮演重要但不必需的角色。（3）弓形虫磷酸盐转运蛋白功能研究对弓形虫进入宿主细胞后上调的跨膜蛋白进行分析,我们发现10个潜在的转运蛋白,其中TGGT1＿235150,与真菌中的磷酸盐转运蛋白具有同源性。进一步的利用生物信息学分析发现虫体共编码3个潜在的弓形虫磷酸盐转运蛋白TGGT1＿240210、TGGT1＿235150和TGGT1＿278990,分别命名为Pi T1、Pi T2和MPi T。进化分析显示弓形虫磷酸盐转运蛋白分别位于不同的进化分支,Pi T1和MPi T分布广泛,而Pi T2仅分布在成囊型球虫中,且跟真菌中的磷酸盐转运蛋白有一定的同源性。定位表明Pi T1和Pi T2位于弓形虫胞质膜,MPi T位于弓形虫线粒体。在RH中直接敲除Pi T1和MPi T,结果显示敲除这两个基因不影响弓形虫的生长及毒力。条件性敲低Pi T2导致弓形虫死亡,回补Pi T2恢复虫株生长。动物实验表明敲低Pi T2导致弓形虫在小鼠体内生长受阻。表明Pi T2对弓形虫在体内外的存活具有关键作用。酵母实验表明Pi T2能够有效改善磷酸盐转运缺陷菌株在低磷酸盐浓度下的生长状态,说明Pi T2具有转运磷酸盐的功能。综上所述,本研究探讨了猪肺泡巨噬细胞与弓形虫之间的互作机制,发现了猪肺泡巨噬细胞与弓形虫的独特的互作模式,丰富了弓形虫与其宿主相互作用的内容。对Fab D的研究表明FASⅡ途径在虫体中重要但不必需的功能。同时在弓形虫中鉴定出3个潜在的磷酸盐转运蛋白,发现在成囊型球虫中特异的磷酸盐转运蛋白对弓形的存活至关重要,这些结果为弓形虫药物设计等提供了重要信息。