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铁基纳米酶调控细胞氧化—还原环境与白血病耐药

项目来源

国家重点研发计划(NKRD)

项目主持人

张宇

项目受资助机构

东南大学

项目编号

2017YFA0205502

立项年度

2017

立项时间

未公开

研究期限

未知 / 未知

项目级别

国家级

受资助金额

730.00万元

学科

纳米科技

学科代码

未公开

基金类别

“纳米科技”重点专项

关键词

纳米酶 ; 急性髓系白血病 ; 氧化铁 ; 普鲁士蓝 ; 活性氧 ; Nanoenzyme ; Acute myeloid leukemia ; Iron oxide ; Prussian blue ; ROS

参与者

马明；窦骏；王进科

参与机构AI

东南大学

项目标书摘要：本课题成功完成了氧化铁纳米酶活性测量的国家标准的研制，已通过终审并获批准备发布；成功实现了普鲁士蓝纳米酶从40 mL体系逐级放大到3 L、10 L、50 L的宏量制备和质量控制；完成了普鲁士蓝纳米酶标准物质的研制。我们还开发了2 种高效介导AML 细胞基因转染的新型核酸载体(阳离子化多糖纳米粒和阳离子化磁性纳米颗粒核酸转染载体)。构建了尺寸为20纳米的AML耐药细胞特异性靶向磁性纳米探针，完成了AML细胞磁捕获微流控检测芯片的设计加工，完成了微流控芯片测定的荧光定量检测仪研制。另外，我们还成功构建了2种可用于细胞内 ROS调控的新型纳米酶：一种是具双靶向AML细胞的载药普鲁士蓝纳米酶，另一种是超小Pt纳米颗粒复合的靶向铁基纳米酶，两者都能实现对AML细胞的有效靶向杀伤。我们还研究发现：体外氧化铁纳米酶联合阿糖胞苷能表现出比阿糖胞苷单药更强地促进白血病癌干细胞(LSCs)凋亡；体内阿糖胞苷与氧化铁纳米酶联合用药对荷急性髓系白血病(AML)小鼠有更强的治疗效果。

Application Abstract: This project has successfully completed the development of the national standard for the measurement of iron oxide nanoenzyme activity.The macroscopical preparation and quality control of Prussian blue nanoenzyme were successfully achieved by scaling up from 40 mL system to 3 L,10 L and 50 L.The standard material of Prussian blue nanoenzyme was developed.We also developed two novel nucleic acid vectors(cationic polysaccharide nanoparticles and cationic magnetic nanoparticle nucleic acid transfection vectors)that efficiently mediate gene transfection of AML cells.An AML drug-resistant cell specific targeted magnetic nanoprobe with a size of 20 nm was constructed,the design and processing of AML cell magnetic capture microfluidic detection chip was completed,and the development of fluorescence quantitative detector for microfluidic measurement was completed.In addition,we have successfully constructed two novel nanoenzyme that can be used for intracellular ROS regulation:one is a drug-carrying Prussian blue nanoenzyme with double-targeted AML cells,and the other is a composite iron-based nanoenzyme with ultra-small Pt nanoparticles,both of which can effectively target and kill AML cells.We also found that in vitro ferric oxide nanoenzyme combined with cytosine cytosine could promote the apoptosis of leukemia cancer stem cells(LSCs)more strongly than cytosine cytosine monotherapy.The combination of cytarabine and ferric oxide nanoenzyme in vivo has a stronger therapeutic effect on mice with acute myeloid leukemia(AML).

项目受资助省

江苏省

联系人信息

张宇：zhangyu@seu.edu.cn

  • 排序方式：
  • 1
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  • 1.基于分子扩增和荧光免疫层析的核酸检测方法研究及在病原微生物检测中的应用

    • 关键词：
    • 磁珠;DNA提取与纯化;荧光免疫层析;链交换等温扩增;三引物增强链交换等温扩增
    • 庄林林
    • 指导老师：东南大学 张宇
    • 学位论文

    无论是人类还是动物界,都面临着病原微生物的威胁,其中主要以细菌和病毒的危害性较大。及时准确的检测对于科学防控病原传播具有极其重要的意义。作为目前实验室最常用的核酸检测技术,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）已广泛应用于病原微生物的检测。然而,PCR方法要么依赖存在染料使用安全风险的琼脂糖凝胶电泳,要么需使用成本较高的荧光定量设备及配套试剂,且不适于现场即时检测（point-of-care testing,POCT）。近年来发展起来的等温扩增技术突破传统核酸体外扩增的固有限制,弥补了PCR方法在POCT应用方面的短板,但现有方法在引物设计、目标序列及灵敏度等方面仍有局限性,距离广泛应用仍有差距。此外,作为核酸检测的重要步骤,不同类型样本的DNA常规提取方法缺乏通用性,步骤冗繁,且提取的DNA质量也有待提高。针对上述问题,本研究在核酸提取与纯化、常规PCR、等温扩增等方面进行了试剂改良与方法创新。同时,针对不同应用条件下DNA/RNA检测需求,基于荧光免疫层析分别建立定量方法并应用于病原微生物的检测。主要工作如下:（1）基于磁珠的通用型DNA提取及纯化方法的建立。本研究通过优化实验,优选硅羟基磁珠为DNA提取磁珠。在CTAB法裂解液中加入40μL SDS溶液（15%,w/v）进行试剂改良。优选异丙醇为结合液,磁珠优选用量为40μL（30 mg/m L）,最后使用65℃进行洗脱。经实验验证,本研究方法可从多种类型的样本中高效、优质提取基因组DNA。接着,为了对PCR产物进行纯化,避免引物二聚体等对PCR定量产生干扰,建立了一种基于磁珠的核酸纯化方法。通过实验探索确定吸附液体积、PEG-8000工作浓度及Na Cl浓度对不同长度DNA片段的纯化作用,并通过肠炎沙门氏菌PCR产物进行了成功验证。（2）基于荧光免疫层析的PCR定量方法建立及在犬细小病毒2型检测中的应用。使用荧光微球作为荧光信号放大探针,提高了检测的灵敏度。运行缓冲液的优选工作体积为80μL、免疫层析检测时间为2 min。使用磁珠法对PCR产物进行纯化,有效解决了引物二聚体等导致的假阳性问题。该方法能特异性检测犬细小病毒2型,其cutoff值为146（荧光信号值）。检测灵敏度为30 copies/μL,比常规PCR高2个数量级。通过62份临床样品验证,检测结果与常规PCR一致。同时,通过对阳性样本VP2基因测序分析,确定病毒株的抗原类型。该方法操作安全、简单快速,检测结果可实现数字化定量。（3）基于荧光免疫层析的链交换等温扩增定量方法建立及在沙门氏菌检测中的应用。以重要食源性致病菌沙门氏菌为研究对象,通过对链交换等温扩增产物酶切和DNA测序验证了方法的准确性,并对扩增机制进行了分析。基于荧光免疫层析,核酸检测可在30 min内完成,其cutoff值为15,灵敏度为6 CFU/m L（纯培养物）或3×10~4 CFU/25 g（人工感染物）。特异性经89株沙门氏菌和15株非沙门氏菌参考株验证。对236份样品进行检测,结果与常规PCR一致。该方法简单、快速、灵敏且特异,适于病原微生物快速检测（POCT）。（4）基于荧光免疫层析的三引物增强链交换等温扩增定量方法建立及在新型冠状病毒检测中的应用。为提高对RNA的扩增效率以快速检测SARS-Co V-2,建立了一种三引物增强链交换等温扩增方法。通过酶切和DNA测序验证了方法的准确性,并对反应机制进行了分析。基于荧光免疫层析,可在1 h内实现定量检测。Rd RP和N基因扩增可在相同条件下进行,结果重复性好,灵敏度分别为90 copies/μL和70 copies/μL。本方法可特异性检测SARS-Co V-2,与其他临床症状相似的病毒和致病菌无交叉反应。模拟病毒感染物实验表明,Rd RP和N基因检测方法灵敏度分别为200 copies/m L和90 copies/m L,cutoff值分别为11和12。综上,基于磁珠的通用型DNA高效提取方法为核酸检测提供了高质量模板,PCR产物纯化方法为解决引物二聚体等干扰提供了方法支持。PCR定量方法为改进常规PCR提供了新的技术方案。链交换等温扩增方法弥补了现有方法在检测短序列靶标时的短板,且适于POCT应用。这两种定量方法可满足不同序列长度的核酸检测需求。三引物增强链交换等温扩增方法为高效检测RNA病原体提供了新的有力手段。本研究为实验室及POCT等不同应用条件下对不同类型的病原体进行核酸快速检测提供了针对性的解决方案。所建立的方法操作简单、安全、快速、灵敏、可数字化定量且适于推广使用,具有重要的实际应用价值。

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