目的观察逆转录病毒及睫状神经营养因子（CNTF）诱导的成人视网膜色素上皮（RPE）细胞转分化过程中的形态特征与标志物变化。方法成人RPE细胞经携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的逆转录病毒感染后,进一步用脂质体介导CNTF表达质粒进行转染。倒置荧光显微镜观察细胞形态变化,酶联免疫吸附实验、免疫组织化学染色及Westernblotting方法检测细胞产生和分泌CNTF的能力、CNTF受体（CNTFR）、多种神经细胞标志物及信号传导分子一类蛋白酪氨酸激酶（JAK）的表达水平。结果体外培养的成人RPE细胞经GFP逆转录病毒感染后,RPE细胞的形态无明显变化,但开始表达神经元和胶质细胞的某些标志物,如神经丝蛋白（NF）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）;经CNTF表达质粒转染后,持续高水平表达CNTF的RPE细胞出现明显的神经细胞分化,CNTFR的表达量虽无明显变化,但其分布发生改变,主要分布在细胞膜上;此外,信号传导分子JAK表达明显上调。结论体外培养的成人RPE细胞在逆转录病毒及CNTF的影响下可出现明显的神经细胞形态分化,转分化与CNTF-CNTFR-JAK信号传导通路有关。

目的以遗传性视网膜变性RCS大鼠为模型,探讨视网膜下间隙移植表达睫状神经营养因子（CNTF）的人胚肺（HFL）成纤维细胞治疗视网膜变性的可行性。方法通过脂质体将编码CNTF的表达质粒转入HFL成纤维细胞、MTX及ELISA筛选高水平表达CNTF的细胞克隆。手术显微镜直视下经角膜缘后1mm注射5μl含1×105个高水平表达CNTF的HFL成纤维细胞至4～5周龄RCS大鼠右眼视网膜下间隙,左眼不手术或注射PBS作为对照。分别于移植术后2、4、6、8、10、12及15周随机取1只鼠摘除眼球作光镜观察,随机取2只鼠摘除眼球作电镜观察。结果稳定转染CNTF的HFL成纤维细胞能高水平表达CNTF（91046.15pg/ml）,7只经光镜观察的移植眼中的4只,其视网膜外颗粒层明显较对照眼厚,保存的光感受器数量明显较对照眼多（P≤0.002）。14只经电镜观察的移植眼中的10只,视网膜外颗粒层光感受器凋亡明显较对照眼少。在光感受器与视网膜色素上皮间堆积的盘膜碎片亦较少。宿主视网膜色素上皮细胞的形态保存较好,并可见吞噬小体。结论经过CNTF基因修饰的HFL成纤维细胞视网膜下间隙移植能够延缓RCS大鼠视网膜光感受器变性

目的探讨移植表达睫状神经营养因子（CNTF）的细胞对SD大鼠视神经横断伤后视网膜节细胞的保护作用。方法通过脂质体将CNTF表达质粒转移至人胚肺成纤维细胞,建立稳定、高水平表达CNTF的细胞株。采用双侧背外侧膝状体及上丘核团注射3%荧光金逆行标记视网膜节细胞。将标记后的大鼠分为两组,于标记后7d手术切断眶内段视神经其中一组左眼不做手术作为正常对照组,右眼切断视神经作为手术对照组;另一组双眼均手术切断视神经,左眼注射PBS作为治疗对照组,右眼视网膜下移植表达CNTF的细胞作为实验组。术后5、14、17、21及28d取出眼球,铺片后荧光显微镜观察并计数视网膜内存活的节细胞。结果手术切断眶内段视神经后2周,视网膜内节细胞数减少6744%,视网膜下移植表达CNTF的细胞后第5、17、21d视网膜内存活的节细胞数明显多于治疗对照组（P＜005）。结论视网膜下移植高水平表达CNTF的细胞对视网膜节细胞有保护作用。

目的探讨阻断培养的成人视网膜色素上皮（retinalpigmentepithelium,RPE）细胞产生血管内皮细胞生长因子（vascularendotheliumgrowthfactor,VEGF）后对RPE细胞形态及生长的影响。方法利用脂质体将编码反义VEGF的表达质粒导入RPE细胞,再利用新霉素（neomycin,又称G418）筛选稳定转导反义VEGF的RPE细胞克隆,采用倒置显微镜观察、免疫荧光及免疫组化染色、酶联免疫吸附（ELISA法）技术,观察细胞形态、产生VEGF的能力及细胞标志物的变化。结果持续阻断成人RPE细胞产生VEGF后,RPE细胞的生长受到抑制,同时细胞外基质分泌增加,形态发生转变,酷似神经细胞。RPE细胞产生VEGF减少后,细胞标志物表达也发生变化,视网膜神经元样细胞特异性标志物Thy11及神经丝蛋白转变为阳性,VEGF的受体Flk1表达也明显上调。结论VEGF信号传导通路在调控RPE细胞转分化方面起重要作用。

目的　观察少量、多次玻璃体内注射免疫抑制剂他克莫司 （FK5 0 6 ）对移植到兔眼视网膜下间隙内的人视网膜色素上皮 （retinal pigmentepithelium ,RPE）细胞存活情况的影响。　方法　采用绿色荧光蛋白 （green fluorescent protein,GFP）逆转录病毒感染人 RPE细胞。将 5 0μl（4× 10 3个 /μl）表达 GFP的人RPE细胞悬液注射到 18只白兔及 10只灰兔双眼视网膜下间隙 ,手术后所有兔左眼玻璃体内注射 5 μlFK5 0 6 （5μg/μl） ,每周 1次 ,连续 5周 ,然后间周一次至 2 0周 ;右眼不注射作为对照。眼球壁铺片倒置荧光显微镜观察移植细胞的存活状态。　结果　白兔于移植后 1、2、3、4、6、10、11、14、18、2 0、2 3、2 4、2 5、33、5 4周 ,灰兔于移植后 4、5、6、7、14、18、2 0、2 6周双眼视网膜下均可见表达的 GFP细胞 ,但移植术后 1～ 14周内玻璃体内注射了 FK5 0 6的左眼视网膜下 RPE- GFP细胞形态、细胞膜的完整程度均比未注射的右眼好。 18周后 ,7只白兔和 3只灰兔双眼视网膜下移植细胞的状态差异不明显。眼球切片苏木素 -伊红 （hema-toxylin- eosin,HE）染色观察结果显示 ,移植术后 1～ 6周 ,6只白兔和 3只灰兔右眼脉络膜小血管周围可见灶性或弥散的淋巴细胞 ,应用了 FK5 0 6的左眼淋巴细胞的浸润明显减少。

目的　观察脂质体是否能介导目的基因转移至视网膜及脂质体潜在的毒副作用 ,探讨脂质体在视网膜疾病基因治疗中的应用价值。方法　通过体外细胞转染实验优化阳离子脂质体与质粒DNA的比例 ,然后将脂质体 DNA混合物注射至Spregue Dawley（SD）及Royalcollegeofsurgeon（RCS）大鼠视网膜下间隙 ,荧光显微镜观察目的基因的表达 ,病理学检查及电镜观察视网膜的组织形态学变化。结果　阳离子脂质体介导转移的绿色荧光蛋白表达质粒在视网膜细胞中表达时间 ＞4周。但转染后 4周 ,正常SD大鼠的光感受器外节开始出现肿胀变性 ;8周时光感受器的细胞核明显减少 ,仅剩单层细胞 ,外节脱落或消失 ;双极细胞也出现凋亡 ;视网膜内可见新生血管。 5只 4周龄的RCS大鼠经阳离子脂质体介导睫状体神经营养因子 （cillaryneurotrophicfactor,CNTF）表达质粒转移至视网膜 ,3～ 5周时镜下见 3只实验眼视网膜光感受器保存情况明显比对照眼好。结论　阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至视网膜细胞内 ;脂质体介导的CNTF基因转移对RCS大鼠视网膜光感受器有一定的保护作用 ,但对正常的视网膜神经细胞特别是光感受器有一定的毒副作用。

探讨利用视网膜色素上皮 （retinalpigmentepithelium ,RPE）细胞移植介导目的基因转移至视网膜的可行性。人的RPE细胞在体外经携带绿色荧光蛋白 （greenfluorescentprotein ,GFP）基因的逆转录病毒感染及G4 1 8筛选后 ,手术显微镜直视下经睫状体平坦部注射到兔眼视网膜下间隙。术后通过活体荧光眼底照相 ,荧光显微镜、共聚焦显微镜及透射电镜等观察眼球铺片及切片 ,发现经 gfp基因修饰的人RPE细胞在兔眼视网膜下间隙可存活一年以上。移植的RPE gfp细胞不仅仅局限于移植部位 ,大多扩散到超过 2～ 3个象限的眼底 ,镶嵌于宿主RPE细胞之间或呈单层排列在宿主色素上皮与神经视网膜之间 ,并持续高水平表达GFP。移植后早期玻璃体内每周注射免疫抑制剂普乐可复 （FK5 0 6 ）可明显改善移植细胞的存活状态

目的 建立能稳定且高水平表达人睫状神经营养因子（CNTF）的永久细胞株。方法 采用阳离子脂质体介导CNTF表达质粒转染C2C12、NIH3T3、HLF、CRL－2302细胞,经氨甲喋呤筛选出抗性克隆后,分别采用原位杂交检测细胞中CNTF mRNA的表达,采用免疫组织化学染色、Western blot方法检测细胞浆中CNTF蛋白质的表达,采用ELISA法检测培养液中CNTF的分泌水平。结果 不同的克隆产生和分泌CNTF的能力不同,但其中产生和分泌CNTF能力最强的克隆其培养液中CNTF的质量浓度分别是C2C12－CNTF 114OOpg/ml、NIH3T3－CNTF 9069.071pg/ml、HLF-CNTF 91046.15pg/ml及CRL-2302－CNTF 77 578.4 pg/ml。 结论 构建的多株细胞株均能持续、稳定、高水平表达和分泌CNTF。