目的:探究三叶苷（trilobatin,TLB）对小鼠急性肝损伤的保护作用及其促进人正常肝细胞L-02的增殖作用。方法:1.通过简单随机法将SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分为7组:空白对照组（Control）、空白+TLB高剂量组（Control+40 mg/kg）、模型组[D-氨基半乳糖（D-galactosamine,D-Gal N）/脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）]、模型+TLB低剂量组（D-Gal N/LPS+10 mg/kg）、模型+TLB中剂量组（D-Gal N/LPS+20 mg/kg）、模型+TLB高剂量组（D-Gal N/LPS+40 mg/kg）、模型+阳性对照组（联苯双酯）（D-Gal N/LPS+Bifendate）。给药组分别给予小鼠相应浓度的TLB或联苯双酯,空白对照组和模型组给予等体积的生理盐水进行预防性给药7天,每天2次。然后采用腹腔注射D-Gal N（700 mg/kg）/LPS（100μg/kg）制备急性肝损伤模型,造模5 h后取材。通过苏木精-伊红染色观察小鼠肝脏病理变化情况;酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）检测血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）水平和炎症相关因子白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、内皮素-1（endothelin-1,ET-1）、IL-4和IL-10的含量,以及活性氧（reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）的活力。2.将人正常肝细胞L-02经不同浓度的TLB处理后,通过噻唑蓝比色法测定TLB作用L-02细胞的安全浓度范围以及对L-02细胞活力的影响;采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷酶（5-bromo-2-deoxyuridine,Brd U）ELISA法和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EDU）荧光染色法分别观察L-02细胞DNA的含量和细胞增殖的改变;通过免疫印迹法分析细胞周期相关蛋白肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α）、周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases 4,CDK4）、cyclin D1以及相关调节蛋白肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、酪氨酸激酶（tyrosine kinase,c-Met）、蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase 1/2,Erk1/2）的蛋白表达。结果:1.D-Gal N/LPS模型组较空白对照组小鼠肝脏组织外观呈暗红色、充血肿大,肝细胞坏死,且出现明显出血、病变和炎症细胞浸润;血清中ALT、AST的水平明显升高;IL-1β、IL-6、TNF-α、ET-1、ROS和MDA的含量均明显增加,IL-4、IL-10的含量和SOD、GSH-Px的活力明显降低。而TLB（10、20、40 mg/kg）预给药组和D-Gal N/LPS+Bifendate组小鼠肝脏外观和颜色明显改善;血清中ALT、AST的水平明显降低;IL-1β、IL-6、TNF-α、ET-1、ROS和MDA的含量显著降低,而IL-4、IL-10的含量和SOD、GSH-Px的活力明显增加。2.与对照组比较,TLB（25、50、100μM）作用L-02细胞72 h能够明显增加L-02的细胞活力,并明显增加Brd U含量及EDU的荧光强度;同时,TLB能够明显下调L-02细胞中HNF4α的蛋白表达,上调CDK4、cyclin D1、HGF的蛋白表达,并增加c-Met的磷酸化水平和其下游Akt、Erk1/2的磷酸化水平。结论:TLB能够通过降低转氨酶水平,减少炎症因子的产生和氧化应激明显改善D-Gal N/LPS诱导的小鼠急性肝损伤;同时,TLB对人正常肝细胞L-02具有促增殖作用,其机制可能与调控HGF/c-Met信号途径有关。

目的:探究三叶苷（TLB）对KK-Ay 2型糖尿病（T2DM）模式小鼠的降血糖作用及其可能的作用机制。方法:将8周龄雄性KK-Ay小鼠随机分为4组:模型组（KK-Ay）、模型+TLB 10mg/kg组（KK-Ay+TLB-10）、模型+TLB 20 mg/kg组（KK-Ay+TLB-20）、模型+Met150 mg/kg组（KK-Ay+Met）。将7周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠随机分为:空白组（WT）、空白+TLB 20 mg/kg组（WT+TLB-20）。KK-Ay组和WT组小鼠灌胃等体积生理盐水（NS）,其余4组小鼠根据分组情况灌胃不同剂量的TLB或Met,每日2次,连续28周。实验过程中KK-Ay小鼠给予高脂高糖饲料喂养,C57小鼠给予普通饲料喂养。每周测1次空腹血糖（FBG）,第20周进行口服糖耐量实验（OGTT）,21周进行胰岛素耐量实验（ITT）,给药结束次日取材收集血液样本、胰腺及肝组织。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脂代谢相关指标:甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、游离脂肪酸（FFA）,氧化应激相关指标:活性氧（ROS）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）以及空腹胰岛素（FINS）;根据FINS和FBG计算稳定模型评估胰岛素抵抗（HOMA-IR）值。采用苏木素伊红（H＆E）染色观察小鼠胰腺组织的形态学改变。免疫组织化学（IHC）法检测小鼠胰岛中INS含量。蛋白质印迹（WB）法检测小鼠胰腺组织中Kelch样ECH关联蛋白1（keap-1）、核因子E2相关因子2（Nrf-2）、血红素加氧酶1（HO-1）、醌氧化还原酶1（NQO-1）、胰岛素受体（IR）、胰岛素受体底物1（IRS-1）、蛋白激酶B（Akt）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、葡萄糖转运蛋白2（GLUT-2）的蛋白表达及肝脏组织中GLUT-2的蛋白表达;p-IR（Tyr1185）、p-IRS-1（Ser 307）、p-Akt（Tyr 312+Tyr 315+Tyr 316）、p-GSK-3β（Ser 9,Tyr 216+Tyr 279）的蛋白水平。结果:KK-Ay组小鼠的FBG较WT组小鼠均显著升高,而KK-Ay+TLB-20组小鼠的FBG较KK-Ay组小鼠的FBG显著下降;在给予葡萄糖后的0、30、60、90、120min时间点,KK-Ay组小鼠的血糖值均明显高于WT组小鼠,而KK-Ay+TLB-20组小鼠以上5个时间点的血糖值与血糖曲线下面积较KK-Ay组小鼠均显著下降;在给予胰岛素后的0、30、60、90、120 min时间点,KK-Ay组小鼠的血糖值均明显高于WT组小鼠,而KK-Ay+TLB-20组小鼠在注射后0、60、90、120 min的血糖值与血糖曲线下面积较KK-Ay组小鼠均显著下降;KK-Ay组小鼠的HOMA-IR值明显高于WT组小鼠,而KK-Ay+TLB-10、KK-Ay+TLB-20组小鼠的HOMA-IR值较KK-Ay组小鼠均显著降低;WT组小鼠的胰岛形态饱满完整,呈圆形或椭圆形,岛内细胞数量丰富且致密,KK-Ay组小鼠的胰岛体积明显缩小,形态不均匀,岛内细胞数明显减少,而TLB能不同程度地改善KK-Ay小鼠胰岛的病理性改变;KK-Ay组小鼠INS的IOD值明显低于WT组小鼠,而KK-Ay+TLB-10、KK-Ay+TLB-20组小鼠较KK-Ay组小鼠INS的IOD值均显著升高;KK-Ay组小鼠较WT组小鼠血清中CAT、GSH-Px、SOD的活力及HDL-C水平明显降低,ROS、TG、LDL-C、FFA水平明显升高;而TLB能够显著升高KK-Ay组小鼠CAT、GSH-Px和SOD的活力及HDL-C水平并降低ROS、TG、LDL-C、FFA水平;KK-Ay组小鼠较WT组小鼠胰腺组织中keap-1、胞核Nrf-2的蛋白表达及p-GSK-3β（Tyr 216+Tyr 279）、p-IRS-1（Ser 307）的磷酸化水平均显著升高,胞浆Nrf-2、HO-1、NQO-1、GLUT-2的蛋白表达及p-GSK-3β（Ser9）、p-Akt（Tyr 312+Tyr 315+Tyr 316）、p-IR（Tyr 1185）的磷酸化水平、肝组织中GLUT-2的蛋白表达均明显降低;而KK-Ay+TLB-20组小鼠较KK-Ay组小鼠胰腺组织中keap-1、胞浆Nrf-2的蛋白表达及p-GSK-3β（Tyr 216+Tyr 279）、p-IRS-1（Ser 307）的磷酸化水平均明显降低,胰腺组织中胞核Nrf-2、HO-1、NQO-1、GLUT-2的蛋白表达及p-GSK-3β（Ser 9）、p-Akt（Tyr 312+Tyr 315+Tyr 316）的磷酸化水平和肝组织中GLUT-2的蛋白表达均明显升高。结论:TLB能够显著降低KK-Ay小鼠的血糖,改善其胰岛素抵抗及脂代谢紊乱,其作用机制可能与调控Nrf-2/ARE和IRS-1/GLUT-2信号途径有关。

目的:研究淫羊蕾次苷Ⅱ（ICS Ⅱ）对脑缺血再灌注损伤（CIRI）后神经炎症的抑制作用及其作用机制。方法:采用大脑中动脉栓塞法建立小鼠局灶性CIRI模型,造模前后小鼠的脑血流（CBF）用组织血流血氧实时成像系统监测;将C57BL/6雄性小鼠采用简单随机法分为假手术组（sham）、假手术+ICS Ⅱ高剂量组（sham+ICS Ⅱ 24 mg/kg）、模型组（model）、模型+ICS Ⅱ低剂量组（model+ICS Ⅱ 6 mg/kg）、模型+ICS Ⅱ中剂量组（model+ICS Ⅱ 12 mg/kg）、模型+ICS Ⅱ高剂量组（model+ICS Ⅱ 24 mg/kg）,共为6个实验组。造模后,给药组分别灌胃低、中、高剂量的ICS Ⅱ（2次/天）进行治疗,连续3 d。假手术组和模型组给予同体积的生理盐水。治疗3 d后,小鼠神经功能的改变采用改良Longa 5分法考察;小鼠脑梗死体积的变化采用2,3,5-三苯基四唑氯化物（TTC）染色法检测;小鼠运动感觉功能采用转棒实验和粘附移除实验观察;小鼠学习记忆功能采用Y迷宫实验观察;小鼠脑缺血半暗带（CIP）中促炎因子白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（i NOS）和抗炎因子白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）的水平采用ELISA法检测;小鼠脑中炎症通路相关蛋白的表达情况采用免疫印迹法（WB）检测;小鼠脑中小胶质细胞特异性蛋白抗体（IBA-1）和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达情况采用免疫荧光染色法检测。结果:造模3天后,模型组的神经功能缺陷评分与假手术组相比明显提高,而与模型组比较,ICS Ⅱ低、中、高剂量治疗组小鼠神经学功能缺陷评分明显下降,其中,ICS Ⅱ中、高剂量组较模型组小鼠的运动感觉功能和学习记忆功能显著改善。与假手术组比较,模型组小鼠脑梗死体积显著增加,而ICS Ⅱ治疗组较模型组小鼠脑梗死体积明显减少。模型组较假手术组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、i NOS的含量显著升高,IL-4和IL-10水平显著下降,而ICS Ⅱ治疗后能够明显降低TNF-α、IL-1β、IL-6、i NOS的水平,明显增加IL-4和IL-10的含量;同时,ICS Ⅱ能够明显减少星型胶质细胞和小胶质细胞的活化数量。此外,ICS Ⅱ治疗组较模型组小鼠脑组织内过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）和PPARγ的蛋白表达明显增加,但对PPARβ的蛋白表达无影响。不仅如此,与模型组比较,ICS Ⅱ能够明显下调小鼠术后脑组织内Toll样受体/核因子-κBp65和NF-κBp50、IκB激酶（IKK）β、IKKα蛋白的磷酸化水平且上调NF-κB的抑制蛋白（IκB）的蛋白表达。结论:ICS Ⅱ具有抑制CIRI小鼠神经炎症作用,其作用与调控PPARα/γ信号途径,进而增加抗炎因子的释放并降低促炎因子的水平有关。

目的:研究三叶苷（TLB）对小鼠脑微血管内皮细胞b End.3的促增殖作用及其对大脑中动脉栓塞（MCAO）诱导的脑缺血再灌注损伤（CI/RI）大鼠血管新生的作用,并探讨其可能的作用机制。方法:1.TLB促b End.3细胞增殖作用的实验研究:MTT法筛选TLB对b End.3细胞的安全浓度范围以及最佳作用时间;TLB处理b End.3细胞72 h后,EDU荧光染色和Brd U ELISA法检测细胞增殖情况;光学显微镜观察TLB对b End.3细胞形态的影响;流式细胞术分析b End.3细胞周期;western blot法检测细胞周期相关蛋白（cyclin D1、CDK4）表达、Sir2家族成员SIRT1-7的蛋白表达、血管内皮生长因子VEGFA的蛋白表达;分子对接和表面等离子体共振（SPR）全自动仪分析TLB和SIRT7的结合情况。2.TLB对脑缺血再灌注损伤大鼠血管新生作用的实验研究:雄性SD大鼠（体重200-220 g）于SPF级动物房适应性饲养1周,采用MCAO法制备CI/RI大鼠模型,缺血2 h后拔出拴线进行再灌注。简单随机法将大鼠随机分为4组:假手术组（sham）、假手术+给药组（sham+TLB 20 mg/kg）、模型组（MCAO）以及模型组+给药组（MCAO+TLB 20 mg/kg）。Sham+TLB 20 mg/kg和MCAO+TLB 20 mg/kg分别按体重给予相应体积的TLB 20 mg/kg;sham和MCAO组分别按体重给予等体积生理盐水,每天2次,分别灌胃1、3、7、14、28天。激光多普勒血流仪监测缺血前、缺血时和缺血后造模过程中大鼠的脑血流（CBF）变化;Longa 5分法对大鼠神经功能损伤程度进行评分;免疫荧光法检测血管标志物PECAM-1（CD31）、新生血管标志物Brd U和功能性血管标记物番茄凝集素（tomato lectin）的表达;酶联免疫吸附法（ELISA）检测大脑缺血半暗带中血管内皮生长因子VEGFA和VEGFR-2的含量;western blot法检测大脑缺血半暗带中蛋白SIRT7的表达。结果:1.TLB促b End.3细胞增殖作用:TLB能够浓度依赖性地促进b End.3细胞增殖并增加S期的细胞比例;TLB不仅能够增加周期相关蛋白cyclin D1和CDK4的表达,还可增加Sir2家族中SIRT6和SIRT7的蛋白表达;此外,TLB能够上调VEGFA的蛋白表达。值得注意的是,通过分子对接和SPR技术分析TLB与SIRT7的亲和力的研究结果显示TLB能够与SIRT7直接结合。2.TLB促CI/RI大鼠血管新生的作用:脑血流监测结果显示,MCAO后大鼠脑血流降至造模前基础血流值的20%以下,缺血2 h行再灌注后,脑血流恢复至基础血流值的80%,提示MCAO诱导的CI/RI模型制备成功;MCAO组大鼠较sham组大鼠神经功能评分明显升高,而MCAO+TLB 20 mg/kg组大鼠给药3、7、14、28天后较MCAO组大鼠神经功能评分明显降低;但是,1天时间点MCAO+TLB 20 mg/kg组较MCAO组的大鼠神经功能评分无差异;MCAO组大鼠较sham组大鼠脑缺血半暗带中新生血管和功能性血管数量明显降低;而MCAO+TLB 20 mg/kg组较MCAO组脑缺血半暗带中新生血管和功能性血管数量明显增加;MCAO组大鼠较sham组在1、3、7、14、28天时间点大鼠脑缺血半暗带中促血管新生因子VEGFA及其受体VEGFR-2的含量明显降低;而MCAO+TLB 20 mg/kg组大鼠在3、7、14、28天时间点较MCAO大鼠脑内VEGFA及其受体VEGFR-2的水平显著增加;此外,MCAO组大鼠较sham组在28天时间点大鼠脑内SIRT7蛋白表达明显下调,而MCAO+TLB 20 mg/kg组大鼠较MCAO大鼠脑内SIRT7蛋白表达明显上调。结论:TLB能够浓度依赖性的促进b End.3细胞增殖并能改善CI/RI大鼠神经功能,其机制可能与调控SIRT7/VEGFA信号通路从而促进脑血管新生有关。

目的:探究淫羊藿次苷Ⅱ（icariside Ⅱ,ICS Ⅱ）抗脑缺血再灌注（cerebral ischemia reperfusion,I/R）诱导的大鼠血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）损伤作用及其可能的作用机制。方法:将雄性SD大鼠,体重250-280 g,于SPF级动物房适应性喂养1周,采用线栓法制备中动脉栓塞模型（middle cerebral artery occlusion,MCAO）。造模后随机分为4组:假手术组（sham）、假手术+ICS Ⅱ组（sham+ICS Ⅱ）、模型组（MCAO）、模型+ICS Ⅱ组（MCAO+ICS Ⅱ）。sham+ICS Ⅱ、MCAO+ICS Ⅱ分别给予ICS Ⅱ（16mg/kg）,sham、MCAO组分别给予等体积生理盐水,连续灌胃3天,每天两次。采用激光多普勒血流监测仪检测造模前后脑内血流动力学的改变;Longa 5分法评分标准评价大鼠神经功能缺陷程度;伊文思蓝染色观察血脑屏障的通透性改变情况;苏木素-伊红染色观察神经元病理改变;尼氏染色观察神经元存活数量;通过TUNEL染色观察神经元凋亡情况;免疫组织化学检测皮质与纹状体区基质金属蛋白酶2,9（matrix metalloproteinases,MMP 2,9）和基质金属蛋白酶抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1）的表达;通过蛋白免疫印迹检测大鼠缺血半暗带claudin5、occludin、ZO 1、Bax、Bcl-2的蛋白表达和MMP2、MMP9、TIMP1、cleaved-caspase3的水平;采用分子对接技术模拟ICS Ⅱ与MMP2、MMP9蛋白的结合情况。结果:栓线插入后,脑血流降至基础血流值的20%,拔出后恢复至80%,提示MCAO模型建立成功。MCAO组大鼠较sham组大鼠神经功能评分显著增加;右脑可见明显伊文思蓝蓝染;大鼠海马、皮质、纹状体神经元排列紊乱,结构改变,核仁固缩、肿大且深染,神经元存活数量明显减少;大鼠皮质、纹状体区以及缺血半暗带MMP2、MMP9表达明显增加、TIMP1表达明显降低,紧密连接蛋白claudin 5、occludin、ZO 1表达明显降低;大鼠海马与皮质区域神经元出现明显凋亡,Bcl-2蛋白表达明显下降,Bax蛋白表达、cleaved-caspase 3水平明显增加。而ICS Ⅱ治疗组较MCAO组大鼠神经功能评分显著降低;右脑伊文思蓝蓝染减少;大鼠海马、皮质、纹状体神经元排列较整齐、结构完整清晰且染色均一,神经元存活数量明显增加;MMP2、MMP9表达明显降低、TIMP1表达明显增加;claudin 5、occludin、ZO 1蛋白表达明显增加;海马与脑皮质神经元凋亡数量明显减少;Bcl-2蛋白表达明显增加,Bax蛋白表达、cleaved-caspase 3水平明显降低;分子对接结果显示ICS Ⅱ能与MMP2、MMP9蛋白直接结合。结论:本实验研究条件下,ICS Ⅱ能减轻I/R大鼠BBB损伤,其机制与通过调控MMP2、MMP9与TIMP1的平衡和抑制caspase 3依赖的凋亡途径有关。

目的:研究淫羊藿次苷Ⅱ（icarisideⅡ,ICS Ⅱ）预处理对脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）的神经保护作用及其作用机制。方法:大脑中动脉栓塞法建立小鼠局灶性CIRI模型,组织血流血氧实时成像系统监测造模前后小鼠的脑血流（cerebral blood flow,CBF）;通过简单随机法将雄性C57BL/6小鼠随机分为7组:假手术组（sham）、假手术+ICS Ⅱ高剂量预处理组（sham+ICS Ⅱ 20 mg/kg）、模型组（model）、模型+ICS Ⅱ低剂量预处理组（model+ICS Ⅱ 5mg/kg）、模型+ICS Ⅱ中剂量预处理组（model+ICS Ⅱ 10 mg/kg）、模型+ICS Ⅱ高剂量预处理组（model+ICS Ⅱ 20 mg/kg）及阳性药依达拉奉预处理组（model+edaravone 4.5 mg/kg）。将雄性Nrf2基因敲除型(Nrf2-/-)和同源野生型(homologous wild type,Nrf2+/+)小鼠随机分为假手术组（sham）、假手术+ICS Ⅱ高剂量预处理组（sham+ICS Ⅱ 20 mg/kg）、模型组（model）、模型+ICS Ⅱ高剂量预处理组（model+ICS Ⅱ 20 mg/kg）。给药组分别给予ICS Ⅱ 5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg或依达拉奉4.5 mg/kg预防性给药7 d（2次/d）,假手术组和模型组灌胃等体积的生理盐水。造模3 d后,分子对接技术确证ICS Ⅱ与Nrf2的结合能力。改良Longa 5分法观察小鼠神经功能的改变;TTC染色法观察小鼠脑梗死体积的变化;液相色谱-串联质谱联用仪检测小鼠脑组织中ICS Ⅱ存在情况;ELISA检测小鼠脑缺血半暗带中活性氧（reactive oxygen species,ROS）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的活力。结果:研究结果显示,模型组较假手术组小鼠的神经功能评分和脑梗死体积明显升高,小鼠脑组织中ROS和MDA的含量显著增加,SOD的活力显著降低;而ICS Ⅱ给药组较CIRI模型组小鼠的神经功能评分和脑梗死体积明显减少,ROS和MDA的含量显著降低,SOD的活力明显增加;此外,ICS Ⅱ可促进CIRI小鼠的血流量恢复并可透过血脑屏障;值得注意的是,ICS Ⅱ与Nrf2的结合自由能为-7.06 kcal/mol,表明ICS Ⅱ能够与Nrf2结合,其相互作用位点主要包括Val608、Val370、Val369、Arg326和Thr609。在此基础上,我们通过Nrf2-/-小鼠进一步研究Nrf2在ICS Ⅱ保护CIRI中的作用。研究结果表明,Nrf2-/-模型组小鼠较Nrf2+/+模型组小鼠的神经功能评分和脑梗死体积明显升高;小鼠脑组织中ROS和MDA的含量显著增加,SOD的活力显著降低;而ICS Ⅱ预处理对小鼠CIRI的保护作用及其对恢复CBF的作用在Nrf2-/-CIRI小鼠模型中被部分取消。结论:ICS Ⅱ对CIRI小鼠具有神经保护作用,其作用可能与调控Nrf2/抗氧化途径有关,但是,其作用机制有待于进一步研究。

目的:研究马钱子毒性成分士的宁致大鼠神经毒性的作用及其毒性易感机制,筛选得到毒性易感标志物并进行验证,为马钱子的临床安全用药提供参考。方法:1.马钱子生物碱的急性毒性动物实验:观察马钱子主要成分士的宁及马钱子碱的急性毒性作用,不同剂量单次灌胃给药,观察记录大鼠的毒性反应并统计死亡数量,采用Bliss法计算半数致死量(LD50)。2.士的宁的神经毒性动物实验:雄性SD大鼠随机分为对照组（CG）及士的宁组（STR）,STR组单剂量给予士的宁溶液,CG组灌胃同等体积双蒸水,观察大鼠给药后的毒性反应,根据改良Racine量表进行毒性评分,苏木素-伊红染色观察神经元病理变化,Elisa法测定海马、纹状体及皮质组织中ROS、MDA、SOD及GSH水平。3.筛选潜在的士的宁致神经毒性易感标志蛋白:建立HPLC-MS/MS法测定大鼠血浆、海马、纹状体及皮质组织中士的宁的浓度,根据改良Racine量表进行毒性评分,Elisa法测定海马、纹状体、皮质组织中ROS、MDA、SOD及GSH水平,蛋白组学分析肝脏及十二指肠中CYP450酶、UGT酶及ABC转运酶的表达水平,将各项指标进行相关分析,筛选出与神经毒性显著相关的蛋白作为潜在的士的宁毒性易感标志蛋白。4.易感标志蛋白CYP3A1的验证:采用苯巴比妥钠及酮康唑制备CYP3A1酶活性差异的大鼠模型,单剂量灌胃士的宁后,根据Racine量表进行毒性评分,测定大鼠肝脏中Cyp3a1的表达水平,苏木素-伊红染色观察神经元病理变化,测定大鼠血浆药物浓度及海马、纹状体、皮质组织中士的宁的浓度和ROS、MDA、SOD、GSH水平。结果:1.急性毒性动物实验结果:计算得到士的宁的大鼠LD50为6.851mg/kg,马钱子碱的大鼠LD50为337.814mg/kg,选择士的宁作为马钱子代表性的毒性指标成分深入研究。2.纹状体和皮质可能是士的宁的主要靶位:单剂量口服士的宁可诱导大鼠出现癫痫、惊厥等反应,与CG组比较,STR组大鼠的神经毒性评分明显增加,纹状体中纹状小体数量减少且形状模糊,纹状体及皮质组织中ROS、MDA、SOD及GSH水平明显升高,且差异具有统计学意义。3.士的宁致神经毒性的潜在易感标志蛋白:大鼠给药后神经毒性评分结果与皮质组织内士的宁浓度呈显著性正相关,纹状体组织中MDA、SOD、GSH水平分别与士的宁浓度呈显著性负相关,血浆内士的宁浓度与海马、纹状体及皮质组织内士的宁浓度呈显著性正相关,提示肝代谢与肠吸收可能是士的宁致神经毒性的易感机制。血浆内士的宁浓度与肝脏中CYP3A1、CYP3A18、CYP3A62、CYP2B3、CYP2C12、CYP2C13、CYP2C70、CYP2D1、CYP2D3、CYP2D10、CYP4F1、CYP4F4、CYP2T1、ABCA6、ABCA8、ABCB7、UGT1A5、UGT1A7C、UGT2B35酶的表达水平呈显著性负相关,与十二指肠中CYP51A1、ABCF2、ABCA3酶的表达水平呈显著性正相关,这22种蛋白可作为潜在的士的宁致神经毒性易感标志蛋白。4.CYP3A1是士的宁致神经毒性的易感标志蛋白:预先给予苯巴比妥钠可明显上调大鼠肝脏中Cyp3a1表达水平,与STR组比较,大鼠的神经毒性评分结果明显降低,纹状小体无明显的病理学改变,血浆、海马、纹状体及皮质组织中士的宁的暴露量减少,ROS、MDA、SOD及GSH水平明显降低。预先给予酮康唑可明显下调大鼠肝脏中Cyp3a1表达水平,与STR组比较,大鼠的神经毒性评分结果明显升高,血浆、海马、纹状体及皮质中士的宁的暴露量明显升高,纹状体中ROS、MDA水平有升高的趋势,皮质中MDA的水平明显升高。结论:士的宁可造成大鼠纹状体中纹状小体形态病变,引起纹状体及皮质组织的氧化应激损伤,纹状体及皮质可能是士的宁的毒性靶区。纹状体内士的宁的暴露量与MDA、SOD及GSH水平负相关,皮质内士的宁的暴露量与神经毒性评分结果正相关,说明士的宁在体内暴露量的差异是造成神经毒性差异的原因。脑药浓度与血药浓度高度相关,证明肝脏代谢和肠吸收功能的差异决定了士的宁诱导的神经毒性的强弱。CYP3A1可能是士的宁致神经毒性的易感标志蛋白。

目的人体羧酸酯酶1（CES1）是重要的丝氨酸蛋白酶家族中的重要成员,在内源性代谢、外源性代谢中发挥重要作用。CES1还是肝脏组织中高表达蛋白质,当组织损伤时,可在血中检测出其明显的升高,是非常特异性的肝脏损伤标志物,根据人体羧酸酯酶1（Carboxylesterase1,CES1）活性腔的特点、底物偏好和催化反应机理,设计一种用于CES1特异性检测的生物发光探针,对探针在体外中药活性成分发现和筛选中的应用进行研究。方法（1）通过查阅文献了解CES1的反应机理和底物偏好性,总结CES1现有探针的优缺点,对探针结构与缺点之间的关系进行分析,确定探针结构设计的方向,并确定新探针的结构。（2）根据目的探针结构设计合成路线,合成探针,通过氢谱和碳谱确定预期探针的化合物结构。依次测量新探针产物波长、酶介导下的水解能力、单酶选择性、反应体系抗干扰能力和酶动力学参数。（3）对新探针进行简单的结构衍生,并对探针衍生化合物的化学属性和生物学属性进行评估,进行简单构效关系分析。（4）通过探针体外高通量筛选体系,研究了一批中药成分对CES1的调节作用,探索探针在中药活性成分发现中的应用。结果合成了结构为（S）-2-（6,7-二氢-[4,5-f]吲哚-噻唑基）-4,5-二氢噻唑-4-羧酸甲酯的新型生物发光探针（（S）-2-（6,7-Dihydro-[4,5-f]indole-thiazolyl）-4,5-dihydrothiazole-4-carboxylic acid methyl ester,简称DDM1）,结构为2-（5-甲基-6,7-二氢-5H-噻唑并[4,5-f]吲哚-2-基）-4,5-二氢噻唑-4-羧酸甲酯（2-（5-Methyl-6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indol-2-yl）-4,5-dihydrothiazole-4-carboxylic acid methyl ester,简称DDM2）,两种探针均具有良好的选择性,抗干扰性,光化学信号输出优于现有探针DME及NLMe。通过筛选五环三萜类化合物,发现了一种具有较好CES1选择性抑制的化合物白桦脂酸,并测试了白桦脂酸细胞层面的抑制,根据抑制强度与结构关系,初步找到五环三萜类化合物对CES1抑制构效关系。结论基于CES1的底物偏好性,在前期研究团队的生物发光探针萤火虫荧光素甲酯衍生物缺陷的基础上,进行四氢吡咯结构衍生,设计合成两种全新的生物发光底物探针DDM1及DDM2;在光学属性、选择性及反应测试体系便捷性等方面,利用包括反应表型等多种评价鉴定技术系统评估了该探针底物的相关属性,并与现有探针进行了对比。DDM1和DDM2在多种属性中均优于已有探针;依据该荧光素酶体系设计的探针在体内整体表征方面,如药物分布、羧酸酯酶在不同动物的各脏器组织间的分布等方面将有非常好的应用前景。研究了中药天然五环三萜类化合物对CES1活性的影响,并对两种类似亚型CES1和CES2的抑制作用构效关系及其规律进行了分析,为中药的相关代谢机制、药物结构衍生优化提供科学研究基础。

早期的药物包括直接源于天然产物或中药均存在严重的ADME属性缺陷,例如多数口服中药的生物利用度不超过1%,而其中代谢稳定性是其主要原因。多索茶碱是甲基黄嘌呤类衍生物,在哮喘和慢性阻塞性肺疾病治疗中属于二线药物。与同类药物如茶碱相比,DOXO疗效好、安全窗宽,尤其是没有心血管系统、神经系统、消化道系统等的副作用及药物-药物相互作用,对并发心血管病的患者是有益的。尽管DOXO已在临床使用多年,但在不同患者中,其有效性差异大（不少患者效应弱）,药理学作用机理不明确,特别是发挥作用的本体活性物质至今未被阐明;与茶碱、咖啡因等母核相似的同类化合物相比,其代谢过程不清晰,是因历史原因导致的一个典型范例,在70年代末上市以来,其ADME属性一直未被阐明。本研究基于全新的体外与体内人源性代谢比较研究理念,利用药物代谢反应表型鉴定及归属技术,通过对比人肝微粒体、人肝S9以及人体健康受试者体内的整体代谢特征,对DOXO的代谢通路进行了系统性研究;在基本阐明了DOXO的P450与非P450的I相代谢基础上,将代谢过程作为探针模式,考察了23种来源于有毒中药的单体成分,观察了这些有毒是否可对P450和非P450的I相代谢产生影响。研究获得的主要结果如下:1.平行比较了DOXO在人肝微粒体（HLM）体系与人肝S9（HLS9）体系中的代谢差异后,发现DOXO首先在NADPH存在的微粒体体系中启动催化并转变为茶碱乙醛（M1）,后者在HLS9催化下,分别依赖NADP+氧化为茶碱乙酸（M2）、及依赖NADPH还原为羟乙基茶碱（M4）。也即在HLS9中,茶碱乙醛发生NADP+/NADPH辅助催化的歧化反应。DOXO在体外的UGT代谢酶转化体系中,未检出任何代谢物。2.健康受试者静脉滴注DOXO后的药动学研究结果显示,DOXO在人体内主要代谢为茶碱乙酸与羟乙基茶碱,体外最重要的代谢产物茶碱乙醛在血浆中的含量极微。原型药物、茶碱乙酸和羟乙基茶碱AUC与总AUC比值分别31%、38%和30%,原型药物呈现单相消除特点。给药8小时后,DOXO血浆浓度低于检测下限;茶碱乙酸血浆浓度降为峰值浓度的1.5%;而羟乙基茶碱消除速度明显低于DOXO和茶碱乙酸,血浆浓度仅降为峰值浓度的一半。3.利用药物代谢研究新技术,对DOXO在HLM与HLS9中的代谢进行代谢反应表型鉴定。结果显示:DOXO在微粒体中被CYP1A催化,将其侧链上的缩醛环氧化裂解,生成茶碱乙醛,CYP1A是DOXO代谢启动的特异性氧还酶。进一步利用HLS9对茶碱乙醛代谢反应表型进行了归属鉴定,初步判别认为HLS9中的醛氧还酶是驱使该歧化反应的主要因素;选择性抑制剂研究表明,这些醛氧还酶可能是醛氧化酶（AOX）、醛酮还原酶（AKR）、醛脱氢酶（ALDH）;黄嘌呤氧化酶（XO）不参与这一反应;4.对市售获得的5种醛氧还酶单酶的体外代谢研究表明,5种酶分成三种类型:第一种类型的AOX1和AKR1A1催化NADPH依赖的茶碱乙醛还原为羟乙基茶碱的代谢反应,消耗NADPH生成氧化型NADP+;第二种类型的ALDH1A1催化NADP+依赖的茶碱乙醛氧化为茶碱乙酸的代谢反应,生成NADPH;第三种类型的AKR7A2和ALDH3A1催化茶碱乙醛依赖NADP+/NADPH的歧化反应,其NADP+与NADPH消耗量或产生量取决于反应环境的NADP+与NADPH比值;以上研究说明,茶碱乙醛的氧还歧化代谢反映了细胞内的氧化还原状态。5.考察了23种中药单体成分对DOXO在HLS9中的连续两步代谢反应的影响,筛选出11种有抑制作用的单体。进一步研究发现蛇床子素、花椒毒素、欧前胡索、芫花素、吴茱萸次碱、白芷素六种单体成分对CYP1A有强烈的抑制活性;而蝙蝠苏林碱、马卡因、山豆根酮对茶碱乙醛歧化中氧化反应有明显抑制。DOXO的代谢作用涉及基于P450和非P450I相代谢氧还机制的连续过程,肝内代谢分为两步:1)DOXO经肝内质网中CYP1A代谢为茶碱乙醛,第一步反应为限速步骤;2)茶碱乙醛经胞浆中醛氧还酶歧化转变为茶碱乙酸和羟乙基茶碱,第二步反应速率显著高于第一步反应且有多种酶参与,其中,歧化反应速率与歧化程度受氧还对辅因子的氧还类型影响。上述两步反应均需要NADP+/NADPH的参与,均为氧还还原机制;3)在血液中无法发现上述连续过程,只能获得最终代谢产物的结果,因此,仅实用整体动力学研究方法有严重局限性;4)上述两步反应中,特别是茶碱乙醛的歧化反应是首次发现,所涉及的代谢酶如AOX、AKR、ALDH等大量参与内源性代谢,因此,将其作为代谢模型对23种中药成分的影响作用进行了研究。23种成分全部源于有毒中药,多数表现出影响体内氧化还原作用的活性或效应,我们的研究表明,有6种成分对第一步反应CYP1A催化代谢抑制作用强烈;有3种对歧化反应有抑制或影响作用。该研究值得深入进行。