土壤盐渍化是当前最主要的环境问题之一,它会给植物带来离子毒害、渗透胁迫以及一系列的次生效应,例如氧化胁迫,导致植物生长抑制,作物产量降低。而揭示植物的耐盐机制能为培育耐盐新作物提供理论基础。本研究筛选到一个盐敏感的T-DNA插入突变体SALK＿108751,在盐胁迫下表现为主根伸长抑制、分生区长度缩短以及过渡区和伸长区出现肿胀形态的表皮细胞。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和回补实验,确定了磷酸乙醇胺N-甲基转移酶PMT1的突变是导致突变体对盐胁迫敏感的原因。利用遗传学手段,结合一系列生理生化实验,初步揭示了PMT1参与植物耐盐的分子机制,主要的研究结果如下:1.基因表达分析表明PMT1在根中的表达显著高于PMT2和PMT3,其中PMT1和PMT2都能受Na Cl诱导上调,且PMT1的上调更为明显,PMT3的表达受Na Cl处理抑制。盐敏感分析试验发现pmt1而非pmt2或pmt3单突变体对盐胁迫敏感。双突中,pmt1 pmt2在盐胁迫下表型与pmt1单突相近,pmt2 pmt3对盐处理不敏感,pmt1 pmt3存在发育缺陷,依据现有的证据,我们认为不同PMTs在盐胁迫响应过程中功能不冗余,并且PMT1是拟南芥幼苗中参与调控盐胁迫下主根伸长的关键磷酸乙醇胺N-甲基转移酶。2.盐胁迫下,pmt1根分生区长度缩短,细胞数目减少,通过引入CYCB1;1:GUS和DR5:GUS报告株系到pmt1和WT中,我们发现,盐胁迫抑制了根分生区细胞的分裂,改变了根对生长素的响应。且ABA处理也能模拟这种现象。表明Na Cl以及ABA对主根发育的调控都依赖于PMT1介导的分生区活性的维持。3.离子含量测定结果显示,pmt1在盐胁迫下主根伸长抑制并非由K+/Na+比的改变所导致的。进一步进行甘油脂含量测定。数据表明,在不含Na Cl的培养基生长,pmt1根中仅磷脂酰乙醇胺的丰度高于WT。在含有Na Cl的培养基生长后,pmt1根中磷脂酰胆碱和单半乳糖二酰甘油的含量都比WT低,但三酰甘油和磷脂酸的含量比WT高,表明盐胁迫改变了pmt1根中甘油脂的代谢。外源添加大豆卵磷脂能恢复突变体在盐胁迫下根短的表型。可见,pmt1的主根伸长与PMT1依赖的甘油脂的代谢相关。4.通过JASPAR在线软件分析,我们发现PMT1的启动子中存在ABA响应元件（ABREs）,且外源ABA能够诱导PMT1的表达。而在突变体aba2-1及pyl112458-T中,这种调控减弱甚至完全消失,表明Na Cl调控PMT1的表达依赖于ABA信号途径。5.pmt1突变体的主根对外源ABA敏感,单在pmt1的背景下敲除ABA2能有效缓解盐胁迫下pmt1根伸长的抑制以及表皮细胞不规则的凸起。表明盐胁迫下pmt1的根伸长受到抑制和外表皮细胞肿胀与ABA相关。6.NBT和DAB显色表明,Na Cl处理导致pmt1根中柱有更多的H2O2和O2-的积累,并且H2O2在pmt1根分生区的面积缩小。然而外源添加GSH并不能明显缓解pmt1在盐胁迫下的主根受到抑制的表型,表明盐胁迫导致pmt1根尖ROS的分布更可能是造成主根发育受阻的原因。并且,盐胁迫下,pmt1-2 aba2-1中ROS的积累和分布更偏向于WT或aba2-1而非pmt1-2,表明ABA可以通过调节pmt1中ROS的稳态并影响根系发育。综上,盐胁迫依赖ABA信号调控PMT1的转录,PMT1通过影响细胞分裂,生长素分布,甘油脂代谢等调控盐胁迫下根系发育,且PMT1依赖的脂质合成能够缓解盐胁迫下ABA诱导的活性氧的爆发,从而维持细胞膜的完整和主根伸长。

磷是植物生长发育必需的大量营养元素。植物对磷的吸收主要依赖于质膜（PM）定位的磷酸盐转运体（PT）。PT从内质网（ER）运输到PM这一过程需要PHF1的协助,PHF1是一种能促进PT从ER离开的Sec12相关蛋白。拟南芥或水稻中的PT受磷酸化修饰,PT磷酸化状态会影响其从ER到PM的运输。前人的研究表明蛋白激酶OsCK2（CASEIN KINASE2）能够磷酸化OsPT2和OsPT8,从而减弱它们与OsPHF1的相互作用,最终导致PT滞留在ER中。由蛋白激酶与蛋白磷酸酶调节的蛋白磷酸化是一种可逆的转录后调控方式,在控制蛋白定位、活性及稳定上具有重要作用。然而目前尚不清楚哪个磷酸酶调控PT去磷酸化。本研究中,我们鉴定了一个PP2C家族的蛋白磷酸酶OsPP95,它能在体内和体外与OsPT2和OsPT8相互作用。OsPP95能在OsPT8的Ser-517位点处去磷酸化OsPT8,而Ser-517位点也是OsCK2磷酸化OsPT8的位点。OsPP95的过表达会降低OsPT8的磷酸化水平,从而促进OsPT2和OsPT8从ER到PM的转运,最终导致磷在水稻中的积累。在供磷充足的条件下,OsPP95的突变并不会改变整株植物的磷含量,但与野生型相比,ospp95突变体新叶中的磷浓度会降低,而老叶中的磷浓度会增加。此外,我们的研究表明,OsPP95蛋白在磷充足条件下快速降解,因此水稻中的OsPP95蛋白在缺磷生长环境下要比在高磷生长环境下积累的更多。通过进一步研究,我们发现OsPHO2可以与OsPP95相互作用并降解OsPP95。综上所述,我们发现并鉴定了一个受OsPHO2负调控的蛋白磷酸酶OsPP95,它通过去磷酸化PT影响其从ER向PM的转运,并正调控植物对磷的吸收与分配。本研究揭示了一种可逆的PT蛋白磷酸化机制,这对植物适应磷浓度不断变化的外界生长环境是必不可少的。

土壤中的有机氮、无机氮能够在微生物的矿化和同化作用下互相转化。土壤有机氮主要包括氨基酸、小分子的肽和蛋白质,其中游离氨基酸的浓度可高达150 μM,以天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸以及丙氨酸为主要存在形式;土壤中无机氮则主要以硝态氮和铵态氮的形式存在。水稻（Oryza sativa）能够从土壤中直接吸收无机氮和有机氮。无机氮主要是由定位在水稻根系的硝转运蛋白和铵转运蛋白负责运输到根中,并在根系的质体中同化为氨基酸。此外,预测水稻根系吸收氨基酸主要是由定位在根系质膜上的氨基酸转运蛋白负责,但目前分子机制尚不清楚。水稻根系吸收和同化的氨基酸通过木质部和韧皮部运输到库器官中,满足水稻的生长需求。氨基酸作为水稻体内最主要的氮转运形式,从源到库的长距离跨膜运输过程主要是由膜上的氨基酸转运蛋白负责。亚洲栽培水稻主要分为籼稻（indica）和粳稻（japonica）两个亚种。在水稻全基因组中,至少有85个不同类型的氨基酸转运蛋白基因,包括19个氨基酸通透酶AAP（amino acid permeases）基因、6个赖氨酸组氨酸转运蛋白 LHT（lysine-histidine transporters）基因。已报道的 OsAAP3、OsAAP5 和OsAAP6均没有证据表明其直接参与水稻根系氨基酸的吸收。本研究通过水稻自然群体中籼稻和粳稻的全部氨基酸转运蛋白基因与根系吸收天冬氨酸速率之间的关联分析,筛选到负责水稻根系氨基酸吸收的关键基因,OsLHT1。在此基础上,通过基因编辑创制了Oslht1突变体株系,深入分析了 OsLHT1对水稻氨基酸吸收、转运、生长发育以及抗稻瘟病的影响。所获得的主要结果如下:1.发现粳稻和籼稻根系均可以直接吸收氨基酸,但两者存在显著的遗传差异,粳稻吸收能力普遍强于籼稻。在无菌营养液栽培条件下,供试的38个粳稻品种根系对15N标记的天冬氨酸（0.1 mM 15N-aspartate 2小时）的吸收能力平均约为30个籼稻品种的1.5倍。2.通过对全部预测的85个氨基酸转运蛋白基因的自然变异与根系15N-aspartate吸收能力的关联分析,发现OsLHT1是关联度最高的氨基酸转运蛋白基因。发现无论是15N-aspartate吸收量还是OsLHT1的表达量,粳稻均显著高于籼稻,15N-aspartate吸收与OsLHT1表达存在正相关关系。3.发现OsLHT1在水稻根系和叶片中表达丰度均较高。在启动子融合GUS报告基因的转基因材料中,主根和侧根均检测到很强的GUS信号,根系横切的染色结果表明,GUS信号主要在表皮、内外皮层和中柱鞘等部位。此外,OsLHT1在叶片的维管组织和周围的薄壁细胞中均有表达。4.发现定位在质膜上的OsLHT1能够介导酵母细胞对多种氨基酸的吸收利用。OsLHT1能够回补氨基酸吸收缺失型酵母22Δ10α在13种必需氨基酸为氮源的培养基上生长。发现OsLHT1对15N标记的氨基酸的吸收与底物的浓度有关,表现为饱和动力学特征。当底物为天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺时,OsLHT1的Km值分别为55 μM、48 μM和74μM,即OsLHT1在异源酵母系统中是一个高亲和、底物非特异的氨基酸转运蛋白。5.明确了 OsLHT1在水稻（品种:日本晴）根系吸收氨基酸中的贡献。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术创制了 4个独立的Oslht1突变体株系,用于探究OsLHT1的生物学功能。当用天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺作为氮源处理水稻日本晴野生型和Oslht1突变体株系时,发现在酸性氨基酸培养基上,野生型和Oslht1突变体株系生长有明显差异,说明OsLHT1影响了水稻对酸性氨基酸的吸收。当用0.1 mM 1sN标记的天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸以及谷氨酰胺处理水稻30 min后发现,与野生型相比,Oslhtl突变体根系吸收的氨基酸减少了 40-66%,说明OsLHT1可能是直接参与水稻根系对酸性氨基酸和酰胺吸收的最主要的转运蛋白。6.探明了 OsLHT1对水稻体内氨基酸从根系向地上部转运过程中的影响。用1 mM 15N-aspartate处理水稻野生型和Oslht1突变体株系6小时后发现,野生型的根系和地上部的15N的比例分别为56%和44%,但在Oslht1突变体株系中15N的比例分别为71%和29%。分析Oslht1突变体和野生型根系、叶鞘以及叶片中氨基酸的含量发现,与野生型相比,Oslht1突变体根系中的游离氨基酸含量没有明显差异,但叶鞘和叶片中分别下降了 10%和9%。此外,Oslht1突变体木质部中的氨基酸含量也远低于野生型。这些结果说明OsLHT1功能缺失后,氨基酸积累在了根系,较少地转运到地上部,OsLHT1影响了水稻根系氨基酸往地上部的转运。7.明确了 OsLHT1对水稻生长发育的影响。生殖生长时期,与野生型相比,Oslht1突变体株高下降,地上部穗、叶、茎秆的生物量都显著下降。OsLHT1功能缺失降低了单穗的结实率和粒重,Oslhtl突变体的籽粒产量不到野生型的25%。通过分析扬花期和成熟期野生型和Oslhtl突变体旗叶中游离氨基酸的含量以及营养器官和生殖器官中氮的分配比例,发现Oslht1突变体营养器官中积累了较多的氮,说明OsLHT1影响了氨基酸从叶片到穗中的转运。此外,Oslht1突变体体内氮转运失衡也改变了水稻籽粒中储藏物质的含量,表现为总蛋白含量增加,直链淀粉含量下降。籽粒中储藏物质含量的变化也改变了糊化特征。与野生型相比,Oslht1突变体籽粒的峰值粘度和最终粘度都显著下降。8.发现OsLHT1在水稻抗稻瘟病中具有重要作用。从分蘖盛期开始,Oslht1突变体的叶片出现铁绣红斑块。分析野生型和Oslht1突变体叶片的代谢组分,发现92种代谢物发生了明显变化,主要包含与氮代谢相关的氨基酸以及和花青素合成相关的黄酮类物质。OsLHT1功能缺失能够激活水杨酸和茉莉酸介导的抗性途径,与野生型相比,Oslht1突变体叶片中积累了大量的活性氧。在室内对2周大小的野生型和Oslht1突变体植株进行稻瘟病菌的致病性分析,发现在接种稻瘟病病原菌一周后,野生型叶片产生了大量的病斑,且病斑面积大,呈典型的感稻瘟病特征;而Oslht1突变体株系叶片中的病斑数和病斑大小较野生型都显著减少,且突变体叶片上的病斑不能正常扩展。说明OsLHT1功能缺失后增强了水稻对稻瘟病的抗性。上述结果揭示了水稻氨基酸转运蛋白OsLHT1不仅直接负责根系对氨基酸的吸收,参与氨基酸从根系往地上部转运以及叶片往穗中的转运过程,影响水稻的生长发育和产量,而且通过维持抗氧化胁迫的能力,介导水稻对稻瘟病的抗性。期待未来通过分子标记辅助育种,选择OsLHT1优异等位基因,或通过基因定向编辑,遗传改良水稻对氨基酸的吸收转运,同时提高水稻氮素利用效率和抗稻瘟病等生物胁迫逆境的能力。

植物生长需要多种营养元素,其中氮是限制植物生长和形成产量的首要因素。植物从土壤中吸收的无机氮源主要为硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+）两种形式。水稻前期主要生长在淹水条件下,根系环境中氮素主要是NH4+,而在水稻生长的后期,干湿交替的灌溉方式会大大增加根际NO3-的含量。此外,水稻具有发达的通气组织,可以将地上部的O2运输到根际并供给根际硝化细菌生长繁殖,与之伴随的硝化作用将根际部分NH4+转化成N03-,从而导致水稻即使在淹水的土壤中也是生长在NH4+和N03-混合供应的环境中。为了适应多变的环境,植物进化出了低亲和（LATS）和高亲和（HATS）两种NO3-转运系统。通常认为植物对NO3-的转运,在高浓度NO3-条件下由低亲和NO3-转运蛋白NPF家族成员负责,而低浓度N03-条件下由高亲和N03-转运蛋白NRT2及其互作蛋白NAR2家族成员负责。根据水稻全基因组的测序结果,预测水稻OsNRT2和OsNAR2家族分别有5个和3个成员,其中OsNAR2.1,OsNRT2.3a和OsNRT2.3b基因的生理功能已得到了较为深入的鉴定,OsNRT2.1/OsNRT2.2和OsNRT2.3a均需要通过与OsNAR2.1的互作才具有转运硝酸盐的功能,而OsNRT2.3b能够独立转运硝酸盐。此外,OsNRT1.1A,OsNRT1.1B,OsNPF2.4也已经明确具有转运硝酸盐的功能。本研究以水稻OsNRT2.4基因为研究对象,主要从以下几个方面开展研究:qRT-PCR分析OsNRT2.4的表达模式;利用水稻原生质体分析了 OsNRT2.4的亚细胞定位;构建OsNRT2.4启动子整合GUS报告基因的转基因水稻,观察OsNRT2.4基因的组织定位;利用非洲爪蟾卵母细胞异源表达系统分析了 OsNRT2.4对N03-和IAA的吸收特性;利用CRISP/CAS9获得敲除突变体,分析了OsNRT2.4敲除对侧根发生及相关基因的影响;通过15N-N03-示踪分析了 OsNRT2.4敲除突变体对NO3-的吸收和再分配;通过田间试验分析了OsNRT2.4敲除突变体和超表达材料的农艺学性状及氮素吸收利用特征。所获得的主要研究结果如下:1.生物信息学分析表明,OsNRT2.4位于第1条染色体上,基因开放阅读框都由一个内含子和两个外显子组成,编码由481个氨基酸组成的蛋白质;OsNRT2.4有10次跨膜结构,N、C端都在细胞膜内侧,而且在第六和第七个跨膜区间有一个较大的中央亲水环。OsNRT2.4蛋白质定位在水稻原生质体的质膜上。2.OsNRT2.4基因的表达受NO3-的诱导,NH4+的抑制。OsNRT2.4基因在叶片中受IAA（10μM）和 JA（10 μM）的诱导表达,而 ABA（0.1μM）和 NPA（1 μM）处理则对OsNRT.4的表达没有影响。3.构建了OsNRT2.4基因启动子融合GUS报告基因的转基因水稻,GUS染色发现OsNRT2.4在根系中只在侧根发生原基中表达,在根茎结合处、叶鞘、叶片中均有表达,在萌发种子中无表达。GUS组织免疫切片观察显示,OsNRT2.4在根系中仅在侧根发生原基表达;而在地上部,OsNRT2.4在叶片、叶鞘和根茎结合处的韧皮部维管束细胞中均有表达。4.通过OsNRT2.4在爪蟾卵母细胞的异源表达分析,发现OsNRT2.4是一个pH依赖性的双亲和NO3-转运蛋白,对NO3-的转运并不需要伴侣蛋白OsNAR2.1,发现OsNRT2.4没有NO3-的外排活性,也不具有转运IAA的活性。5.利用CRISPR/CAS9基因编辑技术获得了OsNTRT2.4敲除的3个水稻突变体株系。研究不同浓度以及形态氮（0.25mM NO3-、2.5 mM NO3-和2.5 mM NH4+）培养下osnrt2.4突变体苗期根系构型,以及N03-调控侧根发育的相关基因的表达。结果显示在0.25 mM NO3-和2.5mM NO3-生长条件下,osnrt2.4突变体的侧根数和侧根长相比野生型都显著降低,在2.5 mM NH4+培养条件下则没有显著差异。水稻OsMADs基因可能与硝酸盐信号控制的侧根发育相关,我们同时检测到OsNRT2.4敲除导致OsMADS23/27/61 基因表达的上调（0.25 mM 和2.5 mM N03-处理）,以及OsM4DS25/57基因表达的下调（0.25 mMNO3-处理）。6.利用osnrt2.4突变体分析了OsNRT2.4敲除后对水稻根系N03-的吸收以及水稻生长的影响。15N-N03-示踪分析发现,在15N03-瞬时吸收实验中,供应0.25 mM和2.5 mM 15N-NO3-10 min后,突变体对15N-N03-的单位根系吸收速率与野生型相比均没有显著差异。而在长期0.25 mM和2.5 mMNO3-生长条件下,突变体根系和地上部干重和总N积累均降低。进一步分析osnrt2.4突变体中部分水稻N03-转运蛋白基因的表达,发现 OsNRT2.4 敲除后OsNAR2.1,OsNAR2.2,OsNRT2.1基因的表达下降,而 OsNRT2.2和OsNRT2.3基因的表达上调。7.通过15N-NO3-示踪分析了OsNRT2.4敲除对水稻体内NO3-转运的影响。从根向地上部的15N-NO3-转运的结果显示,与野生型相比,在0.25 mM 15N-NO3-培养条件下,osnrt2.4突变体中根、茎秆、叶鞘和叶片中15N-NO3-相对分配比例无显著差异,而在5 mM 15N-N03-培养条件下,突变体的茎秆和叶鞘中15N-NO3-相对分配比例增加,而叶片中则降低。进一步分析了 15N-NO3-由老叶向其他部位的再分配,将缺氮培养后的水稻老叶用5 mM 15N-NO3-处理4h,24h检测各个部位的15N,结果发现与野生型相比较,osnrt2.4突变体中15N-N03-相对百分比在根系中降低,叶鞘中增加,而倒一叶中无显著差异。8.在田间实验中,进一步分析了 OsNRT2.4敲除对氮素的吸收利用和水稻生长的影响。在成熟期,与野生型相比,突变体株高、单株产量、千粒重、结实率等农艺学性状均显著降低,叶鞘中氮浓度下降,而籽粒中氮浓度增加。9.我们研究了OsNRT2.4超表达对水稻生长和氮素吸收的影响。结果发现在成熟期时,与野生型相比,OsNRT2.4超表达材料的株高、分蘖数、千粒重、结实率等农艺学性状显著降低,倒一叶、倒二叶和倒三叶中氮浓度下降,而茎秆和籽粒中氮浓度增加。通过对OsNRT2.4超表达水稻中水稻NO3-转运蛋白基因表达分析,发现OsNRT2.4超表达导致OsNAR2.1,OsNAR2.2,OsNRT2.1 和 OsNRT2.2 表达的下调,但其作用机制尚不清楚。综上所述,OsNRT2.4是国际上在植物NRT2家族中第一个被发现的可以不依赖于伴侣蛋白且具有双亲和特征的N03-转运蛋白。在水稻中,OsNRT2.4参与调控不同浓度的N03-诱导的侧根发生和NO3-在体内的转运和低缺氮条件下的再分配。

氮素是生命元素,是植物生长需要量最大的必需营养元素,但同时也是绝大部分农业土壤中难以满足的元素,作物高产离不开氮肥的施用。提高作物的氮素利用效率不仅是重要的科学问题,而且也是节约资源和保护生态环境的紧迫问题。作物的理想根系构型是提高包括氮素在内的养分吸收的重要前提。植物根系形态的构建受到的因素众多,包括了外界因素（如土壤氮素供应）和内部因素（如植物激素）的影响。水稻是中国种植面积最广的农作物,尽管它生长在水田,但是强烈的根际硝化作用使得水稻根系长期处于铵、低浓度硝酸盐并存的土壤环境。生长素是最早发现的一类重要植物激素,大量的研究表明,硝对于植物根系的调控是通过生长素的合成、降解及其局部分配来完成的。在拟南芥中已经鉴定有四种的色氨酸依赖性吲哚乙酸（indole-3-aceticacid,IAA）生物合成途径,其中吲哚-3-乙腈（indole-3-acetonitrile,IAN）已被确定为吲哚-3-乙醛肟（indole-3-acetaldoxime,IAOx）介导的IAA生物合成中的两个关键中间体之一,而腈水解酶则是IAN向IAA的转化过程中的关键酶。此外,在拟南芥和玉米籽粒中也已经证明了内源腈水解酶和其底物IAN的存在,并且用实验证明了这些物种的腈水解酶都可以水解IAN。本实验室之前的研究发现OsNAR2/OsNRT2双组分系统在水稻根系硝酸盐吸收分配和根系对硝酸盐供应的响应中具有关键功能,其中硝酸盐转运伴侣蛋白OsNAR2.1可能参与控制侧根形成的N03-信号传导途径。然而,其作用机制并不清楚。本研究首先以OsNAR2.1为诱饵做了水稻根系蛋白的Pull Down实验,发现预测的腈水解酶蛋白OsNIT1和OsNIT2是潜在的与OsNAR2.1互作的蛋白。在此基础上,深入鉴定了OsNAR2.1与OsNIT1和OsNIT2的互作关系以及互作位置。利用T-DNA插入和CRISPR/Cas 9系统敲除技术获得OsNIT1、OsNIT2突变体,进而通过杂交获得了 osnit2-2×osnar2.1-1双敲除突变体。在此基础上,通过qPCR分析,基因测序和不同氮素条件培养等确认了材料的可靠性和其生理表型;通过15N示踪、氮素浓度测定和田间表型分析,明确了 OsNIT1和OsNIT2在硝酸盐的吸收与转运方面的功能。此外,通过体外酶活性检测和3H-IAA示踪等实验分析了OsNIT1和OsNIT2与IAA合成分配的关系。所获主要结果如下:1.通过酵母双杂交和免疫共沉淀（Co-IP）实验进一步证实了 OsNAR2.1和OsNIT1、OsNIT2之间的蛋白质互作关系。此外,通过qPCR分析,发现水稻根中OsNAR2.1,OsNIT1和OsNIT2的表达都会受到硝酸盐的诱导且表达趋势一致。原位杂交显示,在硝酸盐培养条件下,OsNAR2.1,OsNIT1和OsNIT2在水稻根中的表达模式几乎相同,它们共定位于根尖。亚细胞定位结果也表明OsNAR2.1,OsNIT1和OsNIT2在细胞水平上有一致的定位。2.通过T-DNA插入、CRISPR/Cas9系统和杂交技术获得了osnit1,osnit2,osnar2.1单突变体和osnit2-2 ×osnar2.1-1双突突变体。利用qPCR分析了供硝条件下OsNIT1和OsNIT2在osnar2.1突变体中的表达,发现它们的表达均下调。硝酸盐供给培养时,OsNIT1、OsNIT2和OsNAR2.1的敲除均导致水稻出现主根变短,侧根密度下降的表型。此外,在供硝条件下,双突突变体osnit2-2×osnar2.1-1的主根根长与单突osnit2-2和单突osnar2.1-1都相似,而双突变体的侧根密度与单突osnit2-2和单突osnar2.1-1相比都减少。3.发现OsNIT1和OsNIT2的敲除不会影响根中OsNAR2.1和硝酸盐转运蛋白基因OsNRT2.1和OsNRT2.3的表达。15N同位素示踪实验结果显示,OsNIT1、OsNIT2的敲除并不会影响硝酸盐瞬时吸收速率,这表明OsNIT1和OsNIT2不会反馈影响OsNAR2.1在氮素吸收中的功能。在扬花期时,生长于正常施氮水平土壤中的osnit1和osnit2突变体的总氮浓度与野生型的总氮浓度无显著差异,但由于突变体的生物量低于野生型,突变体的总氮含量对应下降。在成熟期时,osnit1和osnit2旗叶中的氮浓度均低于野生型。这可能是由于OsNIT1和OsNIT2的敲除影响水稻氮素从倒一叶向籽粒运输的能力。与osnar2.1不同,osnit1和osnit2的根系吸收硝酸盐的速率与野生型相同。4.发现外源施加10 μMIAN会强烈抑制水稻（日本晴）主根的伸长。敲除OsNIT1可以增强水稻根系对于IAN的抵抗能力。用10 pMIAN处理osnit1和野生型时,osnit1的主根长度相比野生型增长约140%,侧根密度相比野生型减少约40%。osnit2也表现出与osnit1相似的表型,但敏感度减弱不明显。OsNIT1、OsNIT2的敲除不影响根系对外源施加NAA的响应。这些数据表明,能够被腈水解酶水解成IAA的IAN可能调节水稻根系生长。5.发现OsNIT1和OsNIT2突变会削弱外源IAN对水稻根系生长的影响。利用液相色谱分析了野生型,osnit1和osnit2突变体中IAN和IAA的浓度,结果显示水稻体内未能检测到IAN。发现OsNIT1‘OsNIT2突变体根中总IAA浓度较野生型没有显著差异,表明OsNIT1和OsNIT2在水稻幼苗IAA合成或积累中不起主要作用。此外,[3H]-IAA同位素示踪实验结果显示,无论供铵或供硝条件下,osnit1和osnit2突变体在距根尖0-3 cm处[3H]-IAA含量较野生型下降。该结果表明OsNIT1、OsNIT2的敲除突变体向顶式极性运输IAA的能力较野生型减弱。qPCR结果表明,与野生型相比,osnit1和osnit2突变体根中OsPIN1c和OsPIN1d的表达会受到抑制,而OsPIN2,OsGH3-2,OsGH3-8和OsGH3-13的表达会上调。由此可以得到结论,OsNIT1和OsNIT2可以通过改变生长素向顶式的运输和局部分布,调节水稻根系的生长。6.体外酶活测定结果表明,OsNIT1具有独立水解IAN酶的活性,但单独的OsNIT2或OsNAR2.1均不具有这种活性。然而,在酶水解反应体系中,将OsNIT1和OsNIT2共表达,或是将OsNIT1、OsNIT2和OsNAR2.1三者一起共表达,OsNIT1水解IAN的活性可以分别提高3.2倍和5.3倍。这些结果表明,OsNAR2.1和两种NIT蛋白的相互作用在激活水稻腈水解酶活性过程中具有重要的生物学意义。7.无论是RT-qPCR还是原位杂交分析,结果均显示供铵可以强烈促进OsNIT1和OsNIT2在根尖处的表达,但不影响OsNAR2.1的表达丰度。较野生型,在供铵条件下,OsNIT1、OsNIT2的敲除会导致水稻出现主根变短,侧根密度下降的表型;OsNAR2.1的敲除没有显著差异。此外,OsNAR2.1和OsNIT2的双突变也显示出与osnit2相似的根表型,表明OsNAR2.1在根系生长对铵的响应中不参与调控NIT蛋白的功能。与野生型相比,在铵溶液中生长的osnit1和osnit2突变体的[3H]-IAA向顶式运输能力发生了变化,而在osnar2.1突变体中未观察到。这些现象都表明,在供铵条件下,OsNIT1和OsNIT2可以独立于OsNAR2.1来调节水稻根系生长。综上所述,OsNIT1和OsNIT2与OsNAR2.1的互作不会影响硝酸盐的吸收但会影响根系生长。OsNAR2.1和OsNIT2可以增强OsNIT1水解IAN成为IAA的能力。OsNIT1和OsNIT2的失活不影响总IAA含量,但会抑制IAA从根尖处向基部（根茎结合处）极性运输的能力。此外,在供铵条件下,OsNIT1和OsNIT2也能调控根系生长,且不依赖于OsNAR2.1,表明OsNAR2.1-OsNIT1/OsNIT2互作模式在水稻根系生长对铵和硝响应中起着十分关键的但具有不同的调控功能。

磷（Phosphorus,P）是植物生长发育所必不可少的大量营养元素之一,广泛参与植物体内的物质合成、能量转移、信号转导等重要的生理生化过程。同时作为重要的生命元素,磷也构成了许多生物大分子的关键组成成分,如核酸、磷脂、磷酸腺苷（ATP）和含磷的酶类等。植物从土壤中获取的磷素的主要形态是无机正磷酸盐（Phosphate,Pi）,由于其很容易被钙、铁、铝等金属阳离子固定或被土壤微生物转化成有机态而导致其在土壤中的移动性和有效性很低。此外,土壤中的无机可溶性磷酸盐的浓度波动很大,在自然生态系统的土壤中其浓度只有几个微摩尔,而在农田生态系统的土壤中其浓度可以达到几百个微摩尔。为了应对磷浓度剧烈变化的土壤环境,植物已经进化出了一系列形态结构和生理生化上的适应机制,包括改变根系构型、增强根系有机酸分泌、与菌根真菌形成互利共生体来提高土壤中磷的有效性以及诱导磷酸盐转运蛋白（Phosphate Transporters,PTs）基因的表达来增强自身对磷的吸收能力等。植物主要是通过在根系细胞质膜上表达一系列磷酸盐转运蛋白来吸收和转运土壤中的磷素。到目前为止,属于PHT1家族的磷转运蛋白被认为在植物磷素吸收和转运中发挥着主要作用。在水稻中,PHT1家族一共有13个成员,尽管部分成员的功能已经被报道,但仍然有个别成员的功能未知,而且在极端低磷环境下发挥作用的PTs仍不清楚。由于水稻是我国最重要的粮食作物之一,因而更深入地开展水稻PHT1基因的功能研究,对解析植物适应自然贫瘠土壤磷素的吸收和转运调控机理以及培育磷高效作物具有重大的意义。本研究以水稻PHT1家族的一个成员OsPHT1;3为研究对象,以水稻模式品种日本晴为实验材料,通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、CRISPR-Cas9基因编辑系统、酵母和蛙卵异源表达体系等研究了 OsPHT1;3的表达特征和功能,所获得的主要结果如下:1.生物信息学分析表明OsPHT1;3基因位于水稻基因组的第10号染色体上,其DNA全长为1977 bp,编码区全长（CDS）为1581 bp,共编码526个氨基酸,以单拷贝形式存在于水稻基因组中,不含有内含子。亚细胞定位分析显示OsPHT1;3为一质膜定位的蛋白。2.酵母和蛙卵异源表达系统显示OsPHT1;3只能在高磷条件下回补酵母磷吸收缺陷型突变体的正常生长和介导蛙卵中的磷酸盐吸收,表明OsPHT1;3具有磷酸盐转运的能力,在异源表达系统中表现出低亲和力的活性。此外,将OsPHT1;3超表达材料在不同供磷水平条件下进行水培实验,并分析了其生长和磷积累情况。结果显示:在正常供磷（200 μM,Pi）和低磷（10 μM,Pi）条件下,与野生型相比,超表达植株均表现出植株矮小,生长缓慢的表型。OsPHT1;3过表达显著提高了水稻根系对磷酸盐的吸收能力,植株根部和地上部的总磷和无机磷浓度分别达到野生型植株的2倍和5倍。32P标记的同位素吸收实验也表明超表达(OsPHT1;3会显著提高水稻磷素的吸收速率。3.利用基因芯片、RT-qPCR技术以及OsPHT1;3启动子融合GUS报告基因材料分析了OsPHT1;3的时空表达模式,结果显示OsPHT1;3的表达受缺磷强烈诱导,且在在根系中的丰度最高。OsPHT1;3的表达丰度随着缺磷时间延长逐渐提高,而当恢复供磷后其表达迅速受到抑制。在地上部,OsPHT1;3的表达也受到缺磷诱导发生显著上调。在老叶、叶鞘以及基部节中OsPHT1;3的丰度较高,而在新叶中其丰度很低。有意思的是,OsPHT1;3在基部节中的表达很特异,只在常规维管束（RVB）和肥大维管束（EVB）的韧皮部中表达。此外,在萌发的种子、花药和颖壳等部位中也检测到了OsPHT1;3的表达。4.在正常供磷（200μMPi）和低磷条件（10μMPi）下,ospht1;3突变体与野生型的无机磷浓度无显著性差异,而在极端低磷条件下（5 μM或1μM Pi）,ospht1;3突变体地上部的无机磷浓度和根系的短期磷素吸收均显著降低,说明敲除OsPHT1;3后损害了水稻根系对磷素的吸收以及磷素由根部向地上部的转运。此外,32P标记的同位素示踪实验表明OsPHT1;3突变后会抑制磷素从老叶（源）向新叶（库）的再分配过程。5.在磷信号网络核心调控基因OsPHR2的突变体和表达植株中检测了OsPHT1;3的表达情况,发现OsPHR2过表达和敲除后会显著增强和降低OsPHT1;3的表达。凝胶阻滞实验（EMSA）显示 OsPHR2可以直接与OsPHT1;3启动子区域上的两个P1BS（PHR1-binding sequence）顺式调控元件相结合。以上结果表明OsPHT1;3直接受OsPHR2的调控。6.RT-qPCR 结果 显示OsPHT1;2、OsPHT1;4、OsPHT1;9以及OsPHT1;10四个PHT1基因的表达在OsPHT1;3超表达和突变体株系缺磷的根系中分别是下调和上调的。系统进化树分析显示OsPHT1;3和OsPHT1;2是水稻PHT1家族中氨基酸序列一致性最高的且均强烈受缺磷诱导的两个成员。酵母双杂交实验（Split-ubiquitin Y2H）、双分子荧光互补实验（BiFC）和免疫共沉淀实验（Co-IP）共同证实OsPHT1;3和OsPHT1;2在质膜上存在着互作。综上所述,我们在水稻中鉴定出一个磷酸盐转运蛋白OsPHT1;3的功能,发现其主要在极端低磷条件下参与水稻磷素吸收、转运和再分配的过程。其研究结果为解析植物适应自然贫瘠土壤磷素的吸收和转运调控机理以及磷高效作物育种提供了重要线索。

磷作为必需的大量元素在植物的生长发育过程中发挥了重要的作用,但土壤中能被植物所利用的磷却非常有限,因此研究植物的缺磷响应机制对培育磷高效利用作物具有重要意义。可变剪接作为转录后调控机制在植物的生长发育和逆境响应过程中发挥着重要的作用。目前关于缺磷响应的调控研究主要集中在转录调控,未见有从可变剪接角度进行的研究报道。SR蛋白是调控生物体内可变剪接过程的重要剪接因子,与植物的逆境响应过程有关。但到目前为止,SR在植物抗逆过程的作用机制仍不清楚,大部分关于植物SR功能的研究以拟南芥为材料展开,在作物（或水稻等作物）中未见相关报道。本研究主要针对SR蛋白在维持水稻磷稳态过程中发挥的功能进行了研究。水稻SR家族共有22个成员,对缺磷条件下水稻SR基因的可变剪接分析结果表明,大部分成员在缺磷条件下存在差异可变剪接。我们收集了 11个SR基因T-DNA插入突变体,通过分析这些突变体中的总磷含量变化,我们发现有10个SR突变体在缺磷条件下地上部总磷含量高于野生型,其中ossr40、osscl57、osrs2z36和ossr33是四个差异幅度最大突变体,分别比野生型高出46.1%、43.3%、49.5%和48.9%。我们挑选了其中磷含量变化幅度较大的两个突变体ossr40和osscl57做进一步的表型分析,结果表明,在磷充足条件下（正常磷和高磷）突变体ossr40和osscl57表现为生长受抑制并且老叶叶尖出现褐色枯斑,而缺磷条件下两个突变体的生长势要好于野生型。突变体ossr40和osscl57的有效磷含量从最新到最老叶呈现不断递增趋势,最老叶中积累了最多的磷。时间梯度实验的结果表明,突变体ossr40和osscl57根和叶片中有效磷的积累速率都要快于野生型,并且能够明显看到最老叶中磷的转出受到抑制。这些结果表明SR家族参与水稻的缺磷响应,SR40和SCL57的突变影响了水稻对磷的吸收和磷从老叶向新叶的再分配。SCL25的可变剪接分析结果表明,水稻SCL25有6条转录本。其中SCL25.1表达量最高且能够产生一个具有完整RRM结构域和SR丰富区域的完整SR蛋白,是SCL25的主效转录本。而其余5条转录本均发生了内含子保留事件,SCL25.2、SCL25.3、SCL25.4和SCL25.5由于引入了一个提前终止的密码子,导致了部分RRM结构域和整个SR丰富区域的缺失,SCL25.6在靠3’端区域由于发生了移码而缺失了部分SR丰富区域。亚细胞定位的结果表明,SCL25.1同大部分的剪接因子一样是一个核定位蛋白。组织定位结果表明SCL25在根的中柱、根茎结合部和叶片均有表达。敲除SCL25对根中有效磷含量基本无影响,但不管是在缺磷条件还是在磷充足条件下突变体老叶磷含量均显著高于野生型,并且在高磷条件下最老叶叶尖出现磷毒害的枯斑。不同磷浓度处理的时间梯度实验结果表明,缺失SCL25会导致水稻中磷从老叶向新叶的再分配过程受到阻碍。SCL25.1和SCL25.2超表达会造成水稻老叶内有效磷含量的升高,SCL25.1超表达对水稻磷含量变化所造成的影响要大于SCL25.2。这些结果表明,SCL25参与调控了水稻体内磷稳态过程,其中SCL25.1在此过程中发挥了重要作用,但SCL25的其他转录本可能也参与了该调控过程。为了进一步了解SCL25的调控机理,我们对水稻SCL25突变体（osscl25-1）与野生型对照进行了高通量转录组测序并且对可变剪接事件进行了比较分析,在突变体osscl25-1和野生型水稻基因组内共检测到四类主要的可变剪接事件,分别为IR、A3SS、A5SS和ES,其中IR事件占多数。SCL25突变并没有对水稻基因组内剪接事件的数量产生影响,但会导致很多差异可变剪接事件产生,并且我们发现发生差异可变剪接与发生差异表达的基因交叉很小。差异可变剪接基因和差异表达基因功能聚类结果表明,这些基因在多个与磷代谢相关的生物学代谢过程中显著富集,如参与‘含磷化合物代谢’和‘磷代谢’等过程。绝大部分已报道过的水稻磷代谢关键调控因子基因并没有发生差异可变剪接或者差异表达,我们仅发现PHR3存在差异A3SS。说明SCL25可能通过调控PHR3和其他磷代谢相关基因的剪接或表达来直接参与调控水稻磷代谢,并且这很可能是除已知磷调控网络之外的新的调控途径,具体机制仍有待进一步研究。此外,部分差异可变剪接基因还显著富集到了亚铁离子运输途径以及与胁迫响应相关的过程,并且我们还观察到SCL25突变体具有低温敏感表型,说明SCL25可能还参与铁稳态和低温等逆境响应过程的调控。综上所述,SR40,SCL57,SCL25等SR蛋白在水稻磷稳态调控过程发挥了重要作用。

水稻（OryzasativaL.）是重要的粮食作物之一,是全球近半数人口的主粮。水稻的根系发育、株型及其对各种生物、非生物胁迫的抗性是其高产、稳产的重要决定因素。根系是作物固着和水分、养分吸收的重要器官;作物株型如水稻的株高、分蘖和叶片角度等则分别是决定其抗倒伏能力和光合作用效率的关键性状。另一方面,稻瘟病是水稻的主要病害之一,可导致大幅减产。此外,作物的抗病性与其生长发育密切相关,已有报道显示通过调控单个基因的表达即可同时实现水稻发育或产量相关性状的改善和抗病性的提高。尽管如此,作物的抗病性与其生长发育的偶联机制尚未得到完全解析。WRKY家族转录因子在植物基因组中数量众多,水稻中共有一百二十多个成员,其广泛参与植物的生长发育及各种生物、非生物胁迫的应答反应。一个WRKY转录因子可同时调控两个或多个看似完全独立的生物学过程。本研究在课题组前期工作的基础上（即发现的一个WRKY转录因子基因OsWRKY72可影响水稻磷稳态和株型）,重新创制了其突变体植株,并结合其超表达材料进一步研究了OsWRKY72对水稻生长发育的作用,并对其在稻瘟病抗性中功能进行了解析。我们取得的主要结果如下:1.前期研究结果显示,OsWRKY72的表达响应外源生长素和脱落酸（ABA）显著上调,而OsWRKY72超表达植株的主根长度显著高于野生型。基于外源施加生长素和ABA均会抑制水稻根伸长,为了研究OsWRKY72在水稻根伸长及其响应外源生长素和ABA中的功能,对正常培养条件以及外源施加萘乙酸（NAA）和ABA条件下OsWRKY72突变体和超表达植株的根系伸长情况进行了分析。结果显示,在对照处理下,突变体和超表达植株的主根长度分别显著低于和高于野生型植株;超表达植株的不定根数显著低于野生型,而突变体不定根数与野生型相比没有差异。在Os WRKY72超表达植株的基部节（不定根发生部位）中,两个编码不定根发生的正调控因子的基因OsGNOM1和Os WOX11的表达没有发生显著变化或显著上调,表明OsWRKY72对不定根发生的调控可能独立于OsGNOM1和OsWOX11或在其下游。在外源施加NAA和ABA条件下,OsWRKY72突变体和超表达植株主根长度相对于野生型植株的变化趋势与对照条件下一致,但OsWRKY72超表达植株对ABA的敏感性显著降低。这些结果表明,OsWRKY72同时参与根伸长和对非生物胁迫的抗性。2.拔节期后,OsWRKY72超表达植株的株高相对于野生型发生显著降低,而oswrky72突变体的株高没有发生变化。OsWRKY72超表达植株的每个节间长度均小于野生型,与本课题组前期研究结果一致。在此基础上,我们又发现OsWRKY72超表达植株茎秆细胞的纵向长度却显著高于野生型,而其细胞数目则显著低于野生型,表明OsWRKY72超表达植株的株高降低是由于其细胞的增殖受到抑制。OsWRKY72超表达植株茎秆中赤霉素信号转导途径的DELLA基因OsSLR1发生显著上调,且凝胶阻滞实验显示OsWRKY72可直接与OsSLR1的启动子片段结合。此外,三个赤霉素生物合成基因（OsKS1,OsKAO和OsGA20ox3）的表达显著增强,而赤霉素钝化基因OsGA2ox4的表达显著下调。鉴于OsWRKY72与OsSLR1二者超表达植株相似的表型,即以株高显著降低为特征的赤霉素缺陷症状,我们推测OsWRKY72是通过激活OsSZLR1的表达以实现对株高的调控,而赤霉素生物合成相关基因表达的增强和其钝化基因表达的减弱是赤霉素信号转导缺陷后的反馈调节所致。另一方面,OsWRKY72超表达植株茎秆横切面直径与髓腔均减小、茎秆壁厚增加。这些表型是否也是由OsSLR1的上调所致有待进一步研究。3.在正常田间种植条件下,生殖生长期的OsWRKY72超表达植株与野生型相比表现出对稻瘟病的超敏感,叶片出现稻瘟病四种典型叶斑之一的褐点型叶斑。据此,我们对幼苗期野生型植株及OsWRKY72超表达植株和突变体的叶片进行水稻稻瘟病真菌（Magnaporthe oryzae;生理小种Guy11）的接种。结果显示,OsWRKY72的表达响应稻瘟病菌和外源茉莉酸、水杨酸均发生上调。与田间观测到的表型不同,Os WRKY72超表达植株对稻瘟病的敏感性与野生型植株相比并无差异;然而,oswrky72突变体却表现出对稻瘟病更强的抗性,表明OsWRKY72是水稻对稻瘟病抗性的负调控因子,且其调控作用可能与稻瘟病真菌的菌种或水稻发育时期有关。通过荧光定量PCR检测了数个抗病相关基因的表达,发现OsPAL9在oswrky72突变体中显著上调。此外,已有报道OsWRKY72可通过抑制茉莉酸生物合成基因OsA OS1的表达以调控水稻内源茉莉酸水平及其对白叶枯病的抗性。OsWRKY72对稻瘟病的抗性是否也是通过茉莉酸途径进行调控的有待进一步研究。综上所述,本研究证明了 OsWRKY72除了维持水稻磷稳态外,还可同时参与根系伸长及其对非生物胁迫的响应、株高的调控以及对稻瘟病的抗性。因此,OsWRKY72是一个整合这些途径中信号转导通路的调控因子,可为赤霉素、茉莉酸信号途径交互作用的解析,以及作物优良性状的聚合提供思路。