中药钩藤为茜草科植物钩藤 exHavil.（UR）,大叶钩藤U.macrophylla（Miq.）Miq.ex Havil.（UM）,毛钩藤U.hirsuta Havil.（UH）,华钩藤 U.sinensis（Oliv.）Havil.（USi）及无柄果钩藤U.sessilifructus Roxb.（USe）的干燥带钩茎枝。钩藤系多基原植物的中药材,是治疗肝风内动、小儿惊痫抽搐要药。本研究对五种基原钩藤的生药学、质量评价方法及生物碱类成分分布等内容进行了深入、系统研究,主要内容如下:1.对钩藤五种基原植物形态进行描述,确定基原植物形态主要鉴别特征。确定五种基原药材的性状鉴别特征,制定药材基原的性状快速鉴别方法。2.利用显微数码成像技术对五种基原钩藤药材的组织构造、显微特征进行系统研究,采用石蜡切片法、冰冻切片法装片,确定五种基原的显微鉴别特征,为钩藤药材品种的组织、显微鉴别提供依据。3.建立了 UPLC-Q-TOF/MS法同时测定钩藤药材中36个成分的定性鉴别分析方法,确定主要生物碱成分的质谱裂解规律及特征碎片离子信息,解析结构与色谱保留行为关系。4.建立了 UPLC-Q-TOF/MS法同时测定钩藤药材中24个生物碱类成分的定量方法。对5种基原22批钩藤药材中指标成分含量进行测定,首次确定钩藤药材指标成分的限量标准,为其质量控制提供参考依据。确定钩藤药材鉴别项指标性成分为IRN（异钩藤碱）、ICO（异去氢钩藤碱）和GME（缝籽嗪甲醚）。提示关注五环吲哚类成分。钩藤药材含量测定指标性成分为钩藤碱（RIN）、毛钩藤碱（HS）。成分含量限量标准为RIN、HS成分含量均不得低于0.03mg/g;两种成分总量不低于0.12mg/g。阐述了五个基原药材生物碱类组分含量的相似性和差异性,为钩藤药材的基原规范化研究提供化学依据。5.进行了钩藤样品UPLC-Q-TOF/MS测定数据的无监督的主成分分析法（PCA）和有监督的偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）,确定出对品种分类贡献最大的9个指标成分。分别为钩藤碱,异钩藤碱,异去氢钩藤碱,去氢钩藤碱,柯诺辛碱,iso-RIN,缝籽嗪甲醚,毛钩藤碱和去氢毛钩藤碱。五种基原中,毛钩藤（UH）、无柄果钩藤（USe）与钩藤（UR）、大叶钩藤（UM）、华钩藤（USi）样品中生物碱类成分的种类和含量差异较大。本研究揭示了五种基原药材生物碱活性组分的分布差异,为钩藤药材的质量控制和质量标准化提供了科学依据。6.进行了钩藤药材总氮、灰分、无机元素含量等评价指标和紫外光谱、薄层色谱、液相色谱等评价方法研究。建立五种基原钩藤药材的紫外-可见吸收光谱判别方法,确定特征吸收峰位及吸光度比值;建立钩藤药材的含氮量凯氏定氮测定法、TLC、HPLC鉴别方法;建立钩藤药材中16种无机元素含量ICP-MS测定方法。并通过相关性分析,探索各评价指标关联程度,为完善钩藤药材质量控制标准提供研究依据。

异去氢钩藤碱（isocorynoxeine）是钩藤（Uncaria rhvnchophylla（Miq.）Jacks）中主要的氧化吲哚类成分之一,具有降压、神经保护、抗炎、血管舒张等药理活性。本论文对异去氢钩藤碱的体内代谢及其机制进行了系统研究,旨在阐明异去氢钩藤碱及钩藤在体内的代谢规律及作用机制,为钩藤复方配伍机制及其临床应用研究提供科学依据。主要内容如下:1.通过大孔树脂、Pre-HPLC等现代分离技术,从钩藤叶中分离得到异去氢钩藤碱单体,并运用波谱学方法鉴定其化学结构。采用TLC及HPLC法对其纯度进行测定,结果表明,制备得到的异去氢钩藤碱纯度大于98%,为异去氢钩藤碱的体内代谢提供了化学物质基础。2.采用UHPLC/Q-TOF MS技术对异去氢钩藤碱大鼠体内代谢产物鉴定进行了系统研究,通过与标准品对比保留时间、UV光谱、特征准分子离子峰和碎片离子信息,并结合Mass Fragment软件进行验证,鉴定了大鼠口服异去氢钩藤碱（40 mg·kg-1）后,血浆、尿液和胆汁中35个代谢产物,其中20个为首次报道的异去氢钩藤碱体内代谢产物。通过代谢产物轮廓,推测水解、氧化、葡萄糖醛酸化、去甲氧基化、异构化和还原反应为异去氢钩藤碱体内主要代谢途径。3.研究了异去氢钩藤碱在大鼠体内血浆药代动力学性质,建立了 UHPLC/Q-TOF MS法测定大鼠血浆中原形药异去氢钩藤碱及7个代谢产物血药浓度的分析方法,并进行了方法学确证,各代谢产物线性范围为:18,19-二去氢科诺新酸和5-氧代异去氢钩藤酸-22-O-β-D-葡萄糖醛酸酯:0.10～20μg·mL-1,18,19-二去氢科诺新酸B:0.05～10 μg·mL-1,去氢钩藤碱:0.02～2.0 μg·mL-1,17-O-去甲基-16,17-二氢-5-氧代异去氢钩藤碱:0.005～0.5 μg·mL-1,5-氧代异去氢钩藤酸:0.10～10 μg·mL-1和5-氧代异钩藤酸:0.01～1.0μg·mL-1,定量下限范围为5～100 ng·mL-1。日内和日间精密度（RSD）均小于15%。准确度在-11.5%～14.7%范围内。7个代谢产物及内标卡马西平在大鼠血浆中的提取回收率均高于80.1%。7个代谢产物在-20℃贮存20天、经3个冻融循环、室温放置24h及提取后室温放置24h等条件下,稳定性良好。采用所建立的UHPLC/Q-TOF MS法,测定了灌胃给予异去氢钩藤碱（40 mg·kg-1）的大鼠血浆中7个主要代谢产物血药浓度,经DAS 2.1.1软件按二室模型处理,得到异去氢钩藤碱代谢产物主要药动学参数。Tmax（h）和AUC（0-∞）（μmol·h·mL-1）分别为:18,19-二去氢科诺新酸0.50±0.32和31.5±10.4、5-氧代异去氢钩藤酸-22-O-β-D-葡萄糖醛酸酯为0.92±0.13和41.9±12.7,18,19-二去氢科诺新酸B为0.63±0.14和21.4±15.4,17-O-去甲基-16,17-二氢-5-氧代异去氢钩藤碱为 0.92±0.56 和 1.79±0.82,去氢钩藤碱为0.75±0.42和5.19±2.12,5-氧代异去氢钩藤酸为0.63 ± 0.26和25.8 ±9.07,5-氧代异钩藤酸为0.75±0.20和1.67±0.70,4个代谢产物18,19-二去氢科诺新酸、5-氧代异去氢钩藤酸-22-O-β-D-葡萄糖醛酸酯、18,19-二去氢科诺新酸B和5-氧代异去氢钩藤酸的AUC（0-t）分别占异去氢钩藤碱代谢物总AUC（0-t）的24.5%、31.9%、16.3%和 19.7%。4.采用人和大鼠肠道菌群、人工胃液、人工肠液、人混合肝微粒体酶、大鼠混合肝微粒体酶及人7种亚型酶分别与异去氢钩藤碱共培养,对异去氢钩藤碱在人和大鼠体内代谢机制进行了系统的研究。为研究人和大鼠肠道菌群对异去氢钩藤碱体内代谢的影响,采用UHPLC/Q-TOF MS技术,在人和大鼠肠道菌群中共鉴定7个代谢产物,还原、水解及氮氧化反应。且异去氢钩藤碱人肠道菌群代谢产物与大鼠肠道菌群代谢产物种类和含量差异不大。异去氢钩藤碱在人和大鼠肠道菌群中可能的代谢途径包括:异构化、还原、水解和氮氧化。研究了人工胃液、人工肠液、人混合肝微粒体酶和大鼠混合肝微粒体分别与异去氢钩藤碱共培养液的代谢产物变化,结果表明:异去氢钩藤碱体内生物转化主要由肝微粒体酶介导,且异去氢钩藤碱在人和大鼠肝微粒体酶中生物转化类似。同时研究了人体中 7 种亚型酶（CYP2A6、CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19和CYP2C9）对异去氢钩藤碱体内代谢的3个关键产物,即18,19-二去氢科诺新酸,去氢钩藤碱及5-氧代异去氢钩藤酸的影响,研究结果显示:CYP2C19、CYP3A4和CYP2D6是催化异去氢钩藤碱体内生物转化的主要亚型酶。

目的研究去氢毛钩藤碱在大鼠体外肠道菌群中的代谢途径,阐明肠道菌群对去氢毛钩藤碱吸收和代谢的影响。方法采用UPLC/Q-TOF MS技术,鉴定并推测了去氢毛钩藤碱在大鼠体外肠道菌群培养液中的代谢产物。采用HSS C18色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.8μm）,以乙腈（A）-体积分数0.2%甲酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱,流速为0.5 m L·min-1,采用ESI离子源,正离子模式下检测。结果通过色谱保留时间及质谱碎片等信息,在大鼠肠道菌群中鉴定了原型化合物去氢毛钩藤碱,以及经还原、氮氧化和羟基化反应后得到的3个微量代谢产物。结论建立了采用UPLC/Q-TOF MS技术鉴定去氢毛钩藤碱在大鼠体外肠道菌群中代谢产物的方法,为吲哚类生物碱在体内吸收和代谢机制的研究提供试验依据。

Ethnopharmacological relevance: The rate of production of reactive oxygen species (ROS) is determined by mitochondrial metabolic rate. In turn, excessive ROS damage mitochondrial function, which is linked to aging and neurodegenerative conditions. One possible path to prevent oxidative stress could be achieved by reducing mitochondrial respiration in favor of less efficient ATP production via glycolysis. Such a shift in energy metabolism is known as the 'Warburg effect'. Geissoschizine methyl ether (GM) is one of the active components responsible for the psychotropic effects of Yokukansan, an herbal preparation widely used in China and Japan.Aim of the study: GM protects neurons from glutamate-induced oxidative cytotoxicity through regulating mitochondrial function and suppressing ROS generation. We investigated the protective mechanism of GM against glutamate-induced oxidative stress in neuronal cells.Materials and methods: The current study was performed on primary neurons and HT22 cells, a hippocampus neuronal cell line. Cell viability was measured by Calcein AM assay. H(2)DCFDA staining was used for intracellular ROS measurement. GSH level was measured using the GSH-Glo (TM) luminescence based assay. Mitochondrial respiration and glycolysis were measured by the Seahorse Bioscience XFe 96 Extracellular Flux Analyzer. Protein levels were analyzed by western blot analysis.Results: GM prevented glutamate-induced cytotoxicity in an HT-22 neuronal cell line even with a 9-hour exposure delay. GM blocked glutamate-induced intracellular ROS accumulation through suppressing mitochondrial respiration. Further, we found that GM up-regulated glycolysis and the pentose-phosphate pathway, which is involved in the production of intracellular reducing agent, NADPH. In addition, GM protected primary cortical neurons from both glutamate and buthioninesulfoximine toxicity.Conclusion: GM prevents glutamate-induced oxidative damage through reducing mitochondrial respiration, which further suppresses ROS generation. In addition, GM up-regulates glycolysis which compensate for the energy depletion induced by mitochondrial respiration inhibition. Overall, our study is the first to report that GM protects neurons from oxidative toxicity by shifting energy metabolism from mitochondrial respiration to glycolysis. (C) 2016 Published by Elsevier Ireland Ltd.

目的研究异去氢钩藤碱在人和大鼠肠道菌群中代谢产物的异同,阐明肠道菌群对异去氢钩藤碱在体内吸收和代谢的影响。方法采用UHPLC/Q-TOF MS技术,鉴定异去氢钩藤碱在人和大鼠肠道菌群培养液中的代谢产物。采用色谱柱为HSS C18（100 mm×2.1 mm,1.8μm）柱,流动相为乙腈-体积分数0.1%甲酸水溶液梯度洗脱,流速为0.5 m L·min-1,采用ESI离子源,正离子模式检测。结果通过与标准品比对保留时间和质谱信息,鉴定了异去氢钩藤碱在人和大鼠肠道菌群培养液中9个代谢产物。其中异构化和还原为异去氢钩藤碱在肠道菌群中的主要代谢途径,水解、羟基化和氮氧化为微量代谢途径。结论建立采用UHPLC/Q-TOF MS方法鉴定异去氢钩藤碱肠道菌群代谢产物,为四环氧化吲哚类生物碱在体内吸收和代谢机制研究提供科学依据。

本研究旨在建立钩藤植物组学质控(Phytomics QC)方法。(1)对钩藤化学成分进行了系统分离，鉴定了26个生物碱,1个新化合物。(2)首次建立了一个UPLC-QTOF/MS法同时定性定量分析钩藤、华钩藤、大叶钩藤、毛钩藤及无果柄钩藤等5种基源钩藤中35种生物碱的方法,22批钩藤含量测定结果与PCA和OPLS-DA多元统计分析结合，阐明了不同基源钩藤药材生物碱成分相似性和差异性，鉴定出对分类贡献最大的7个指标成分。(3)首次分别从灌胃给予异钩藤碱和异去氢钩藤碱大鼠尿中分离鉴定了14种代谢产物,6个为新化合物。(4)首次对比研究了异钩藤碱、异去氢钩藤碱、去氢毛钩藤碱、缝子嗪甲醚等4种不同类型生物碱在大鼠体内代谢特征，建立了UPLC/Q-TOF MS技术从灌胃给予上述4种成分的大鼠血浆、胆汁和尿液中分别鉴定了35个,35个,21个和27个代谢产物,48个代谢产物为首次鉴定，结果表明，水解和氧化是氧化吲哚类异钩藤碱在大鼠体内主要代谢途径,11-O-葡萄糖醛酸化是去氢毛钩藤碱主要代谢途径，缝子嗪甲醚原型是体内主要代谢产物。同时建立了UPLC/Q-TOF MS法测定4种生物碱及其主要代谢产物的大鼠血浆浓度的方法，揭示了4种生物碱及其代谢产物体内药动学特征。(5)证明了钩藤氯仿萃取物为神经保护作用活性部位群，首次解析了15种生物碱抗小胶质细胞活化作用及其构效关系；首次阐明了钩藤碱和异钩藤碱抗小胶质细胞活化作用生物学机制；首次评价了9种吲哚类钩藤生物碱对谷氨酸诱导HT22细胞损伤保护作用及构效关系；首次评价了异钩藤碱、异去氢钩藤碱及其8种代谢产物对谷氨酸诱导HT22细胞损伤保护作用，由此确定了钩藤体内药效物质基础。(6)首次采用PhytomicsQC技术，基于LC/MS高分辨率化学指纹图谱、HepG2 细胞基因组表达的生物指纹图谱、神经保护作用活性验证以及统计学模式评价与计算函数等综合研究，建立了不同基源钩藤药材化学指纹图谱和生物基因表达指纹图谱的植物相似度指数(PSI)评价方法，多层面比较了不同基源钩藤或不同批次华钩藤提取物的相似度，这个化学与生物学综合质量评价方法可有效地、可重复性地表述中药材药学特征。本研究为探索国际化高水平的中药材质量控制标准和质量评价新模式提供了新思路和新方法。